5.4分析步骤
5.4.1提取
称取试样约5 g(精que到0.001g)，置于100ml,离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液(5.2.
3)、2 mL对甲苯磺酸溶液（5.2.6）、5ml乙酸钠缓冲溶液(5.2.5)和20mL乙腈加入约2 g中性氧化铝(5. 2.7),振荡2 min，超声30 min,4 000r/ min离心5 min，将上清液转移至250mL分液漏斗中,向离心管中再次加入20mL乙腈，振摇2 min,4 000 min离心 5min, 合并上清夜至分液漏斗中。
5.4.2液液萃取
加入 50 mL氯化钠溶液(5.2. 9)、50mL二氯甲烷(5.2.2)，旋摇,静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后,在分液漏斗再次加入20 mL二氯甲烷，旋摇,静置分层,收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35°C下减压旋转蒸发(注意:开始时温度不要直接升到35°C，以免冲料损失)至近干,加入5 mL乙腈溶解残渣,备用。
5. 4.3固相萃取净化
将中性氧化铝柱(5.3. 6)串接在PRS柱(5.3. 7)上方,使用前用5 mL乙腈预洗两柱。将5.4.2的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内,在抽真空情况下过柱(保持流速1 mL/ min)。再用5 mL乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5mL乙腈洗涤小柱。
弃去中性氧化铝柱,用乙腈-乙酸钠缓冲溶液(5.2.
8)2 mL、盐酸羟胺甲醇溶液(5.2.4)1 mL洗脱，收集洗脱液，过0. 45 μm微孔滤膜上机测定。
5.4.4 测定
5.4.4.1 液相色谱参考条件
色谱柱:氰基柱，柱长250mm,内径4.6mm;柱后串接氧化铅柱,柱长35mm,内径4.6mm。
流动相:乙腈+乙酸钠缓冲溶液=
60+40。
流速:1.0 mL/
min。
柱温:室温。
进样量:50 μL。
检测波长:600 nm。
5.4.4.2定量测定
调整仪器工作参数,使其处于良好状态。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液(5.2.13)及试样溶液(5.4.3) ,得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。
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