GB 5009.32-2016 食品安全国家标准
食品中9种抗氧化剂的测定
前 言
本标准代替GB/T5009.32-2003《油脂中没食子酸丙酯(PG)的测定》和GB/T23373-2009《食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与叔丁基对苯二酚(TBHQ)的测定》。
本标准与GB/T5009.32—2003相比,主要变化如下:
——标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定”;
——增加了抗氧化剂的种类;
——增加了方法的适用范围;
——增加了液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱质谱联用法。
1 范围
本标准规定了食品中没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚
(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)、没食子酸十二酯(DG)9种抗氧化剂的5种测定方法——高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法、气相色谱法以及比色法。
本标准液相色谱法适用于食品中PG、THBP、TBHQ、NDGA、BHA、BHT、Ionox-100、OG、DG 的测定;液相色谱串联质谱法适用于食品中THBP、PG、OG、NDGA、DG 的测定;气相色谱质谱法适用于食品中BHA、BHT、TBHQ、Ionox-100的测定;气相色谱法适用于食品中BHA、BHT、TBHQ 的测定;比色法适用于油脂中PG的测定。
第一法 高效液相色谱法
2 原理
油脂样品经有机溶剂溶解后,使用凝胶渗透色谱(GPC)净化;固体类食品样品用正己烷溶解,用乙腈提取,必威首页登录平台官网
净化。高效液相色谱法测定,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲酸(HCOOH)。
3.1.2 乙腈(CH3CN)。
3.1.3 甲醇(CH3OH)。
3.1.4 正己烷(C6H14):分析纯,重蒸。
3.1.5 乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)。
3.1.6 环己烷(C6H12)。
3.1.7 氯化钠(NaCl):分析纯。
3.1.8 无水硫酸钠(Na2SO4):分析纯,650℃灼烧4h,贮存于干燥器中,冷却后备用。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙腈饱和的正己烷溶液:正己烷中加入乙腈至饱和。
3.2.2 正己烷饱和的乙腈溶液:乙腈中加入正己烷至饱和。
3.2.3 乙酸乙酯和环己烷混合溶液(1+1):取50mL乙酸乙酯和50mL环己烷混匀。
3.2.4 乙腈和甲醇混合溶液(2+1):取100mL乙腈和50mL甲醇混合。
3.2.5 饱和氯化钠溶液:水中加入氯化钠至饱和。
3.2.6 甲酸溶液(0.1+99.9):取0.1mL甲酸移入100mL容量瓶,定容至刻度。
3.3 标准品
3.3.1 叔丁基对羟基茴香醚:纯度≥98%。
3.3.2 2,6-二叔丁基对甲基苯酚:纯度≥98%。
3.3.3 没食子酸辛酯:纯度≥98%。
3.3.4 没食子酸十二酯:纯度≥98%。
3.3.5 没食子酸丙酯:纯度≥98%。
3.3.6 去甲二氢愈创木酸:纯度≥98%。
3.3.7 2,4,5-三羟基苯丁酮:纯度≥98%。
3.3.8 叔丁基对苯二酚:纯度≥98%。
3.3.9 2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚:纯度≥98%。
注:英文名字、分子式和CAS号见附录A。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 抗氧化剂标准物质混合储备液:准确称取0.1g(精确至0.1mg)固体抗氧化剂标准物质,用乙腈溶于100mL棕色容量瓶中,定容至刻度,配制成浓度为1000mg/L 的标准混合储备液,0℃~4℃避光保存。
3.4.2 抗氧化剂混合标准使用液:移取适量体积的浓度为1000mg/L的抗氧化剂标准物质混合储备液分别稀释至浓度为20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L的混合标准使用液。
3.5 材料
3.5.1 C18必威首页登录平台官网
:2000mg/12mL。
3.5.2 有机系滤膜:孔径0.22μm。
4 仪器和设备
4.1 离心机:转速≥3000r/min。
4.2 旋转蒸发仪。
4.3 高效液相色谱仪。
4.4 凝胶渗透色谱仪。
4.5 分析天平:感量为0.01g和0.1mg。
4.6 涡旋振荡器。
5 分析步骤
5.1 试样制备
固体或半固体样品粉碎混匀,然后用对角线法取四分之二或六分之二,或根据试样情况取有代表性试样,密封保存;液体样品混合均匀,取有代表性试样,密封保存。
5.2 测定步骤
5.2.1 提取
5.2.1.1 固体类样品:称取1g(精确至0.01g)试样(5.1)于50mL离心管中,加入5mL乙腈饱和的正
己烷溶液,涡旋1min充分混匀,浸泡10min。加入5mL饱和氯化钠溶液,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋2min,3000r/min离心5min,收集乙腈层于试管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,加0.1%甲酸溶液调节pH=4,待净化。同时做空白试验。
5.2.1.2 油类:称取1g(精确至0.01g)试样(5.1)于50mL离心管中,加入5mL乙腈饱和的正己烷溶
液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min,3000r/min离心5min,收集乙腈层于试管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,待净化。同时做空白试验。
5.2.2 净化
在C18必威首页登录平台官网
中装入约2g的无水硫酸钠（可用成品柱抗氧化剂检测专用柱）,用5mL甲醇活化萃取柱,再以5mL乙腈平衡萃取柱,弃去流出液。将所有提取液(5.2.1)倾入柱中,弃去流出液,再以5mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脱,收集所有洗脱液于试管中,40℃下旋转蒸发至干,加2mL乙腈定容,过0.22μm 有机系滤膜,供液相色谱测定。
5.2.3 凝胶渗透色谱法(纯油类样品可选)
称取样品(5.1)10g(精确至0.01g)于100mL容量瓶中,以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度,作为母液;取5mL母液于10mL容量瓶中以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度,待净化。
取10mL待测液加入凝胶渗透色谱(GPC)进样管中,使用GPC净化(凝胶渗透色谱净化条件见附录B),收集流出液,40℃下旋转蒸发至干,加2mL乙腈定容,过0.22μm 有机系滤膜,供液相色谱测定。同时做空白试验。
5.3 液相色谱仪条件
a) 色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效色谱柱;
b) 流动相A:0.5%甲酸水溶液,流动相B:甲醇;
c) 洗脱梯度:0~5min流动相(A)50%,5min~15min:流动相(A)从50%降至20%,15min~
20min流动相(A)20%,20min~25min:流动相(A)从20%降至10%,25min~27min:流动
相(A)从10%增至50%,27min~30min:流动相(A)50%;
d) 柱温:35℃;
e) 进样量:5μL;
f) 检测波长:280nm。
5.4 标准曲线的制作
将系列浓度的标准工作液分别注入液相色谱仪中,测定相应的抗氧化剂,以标准工作液的浓度为横坐标,以响应值(如:峰面积、峰高、吸收值等)为纵坐标,绘制标准曲线。9种抗氧化剂液相色谱图见附录C。
5.5 试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到相应色谱峰的响应值,根据标准曲线得到待测液中抗氧化剂的浓度。
6 分析结果的表述
试样中抗氧化剂含量按式(1)计算:
式中:
Xi——试样中抗氧化剂含量,单位为毫克每千克(mg/kg);
ρi——从标准曲线上得到的抗氧化剂溶液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V ——样液最终定容体积,单位为毫升(mL);
m ——称取的试样质量,单位为克(g)。
结果保留三位有效数字(或保留到小数点后两位)。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他
本方法的检出限为没食子酸丙酯(PG):2mg/kg,2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP):4mg/kg,叔丁基
对苯二酚(TBHQ):10mg/kg,去甲二氢愈创木酸(NDGA):4mg/kg,叔丁基对羟基茴香醚(BHA):
10mg/kg,2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100):20mg/kg,没食子酸辛酯(OG):2mg/kg,2,6-二
叔丁基对甲基苯酚(BHT):4mg/kg,没食子酸十二酯(DG):10mg/kg;定量限均为20mg/kg。
第二法 液相色谱串联质谱法
9 原理
油脂样品经有机溶剂溶解后,使用凝胶渗透色谱(GPC)净化;固体类食品样品用正己烷溶解,用乙腈提取,必威首页登录平台官网
净化。液相色谱串联质谱联用仪测定,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。
10.1 试剂
同3.1
10.2 试剂配制
同3.2
10.3 标准品
10.3.1 没食子酸辛酯:纯度≥98%。
10.3.2 没食子酸十二酯:纯度≥98%。
10.3.3 没食子酸丙酯:纯度≥98%。
10.3.4 去甲二氢愈创木酸:纯度≥98%。
10.3.5 2,4,5-三羟基苯丁酮:纯度≥98%。
注:英文名字、分子式和CAS号参见附录A。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 标准物质储备液:准确称取0.1g(精确至0.1mg)固体抗氧化剂标准物质,用乙腈溶于100mL棕色容量瓶中,定容至刻度,配置成浓度为1000mg/L的标准储备液,0℃~4℃避光保存。
10.4.2 标准物质中间液:移取标准物质储备液1.0mL于100mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成浓度为10mg/L的混合标准中间液,0℃~4℃避光保存。
10.4.3 标准物质使用液:移取适量体积的标准物质中间液分别稀释至浓度为0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的混合标准使用液。
10.5 材料
同3.5。
11 仪器和设备
11.1 离心机:转速≥3000r/min。
11.2 旋转蒸发仪。
11.3 液相色谱串联质谱仪。
11.4 凝胶渗透色谱仪。
11.5 分析天平:感量为0.01g和0.1mg。
11.6 涡旋振荡器。
附 录 B
凝胶渗透色谱净化参考条件
凝胶渗透色谱净化参考条件如下:
a) 凝胶渗透色谱柱:300mm×20mm 玻璃柱,BioBeads(S-X3),40μm~75μm;
b) 柱分离度:玉米油与抗氧化剂(PG、THBP、TBHQ、OG、BHA、Ionox-100、BHT、DG、NDGA)
的分离度>85%;
c) 流动相:乙酸乙酯∶环己烷=1:1(体积比);
d) 流速:5mL/min;
e) 进样量:2mL;
f) 流出液收集时间:7min~17.5min;
g) 紫外检测器波长:280nm。
