GB 29694-2013 食品安全国家标准
动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定
高效液相色谱法
1 范围
本标准规定了动物性食品中磺胺类药物残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本标准适用于猪和鸡的肌肉和肝脏组织中的磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、苯酰磺胺、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪和磺胺吡唑单个或多个药物残留量的检测。
2规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试料中残留的磺胺类药物，用乙酸乙酯提取，0.1mol/L盐酸溶液转换溶剂，正己烷除脂，MCX柱净化，高效液相色谱紫外检测法测定，外标法定量。
4试剂和材料
以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、苯酰磺胺、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺吡唑对照品：含量≥99%;磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶：含量≥98%。
4.2乙酸乙酯：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲醇：色谱纯。
4.5盐酸。
4.6正已烷。
4.7甲酸：色谱纯。
4.8氨水。
4.9 MCX柱：60mg/3mL，或相当者。
4.10 0.1% 甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水溶解并稀释至1 000 mL。
4.11 0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL。
4.12洗脱液：取氨水5 mL，用甲醇溶解并稀释至100 mL。
4.13 0.1 mol/L盐酸溶液：取盐酸0.83 mL，用水溶解并稀释至100 mL。
4.14 50% 甲醇乙腈溶液：取甲醉50 mL，用乙腈溶解并稀释至100 mL。
4.15 100μg/mL磺胺类药物混合标准贮备液：精密称取磺胺类药物标准品各10mg，于100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/mL的磺胺类药物混合标准贮备液。-20℃以下保存，有效期6个月。
4.16 10μg/mL磺胺类药物混合标准工作液：精密量取100μg/mL磺胺类药物混合标准贮备液5.0mL，于50mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的磺胺类药物混合标准工作液。-20 ℃以下保存，有效期6个月。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。
5.2分析天平：感量0.00001 g。
5.3天平：感量 0.01 g。
6.4 涡动仪。
5.5离心机。
5.6均质机。
5.7 旋转蒸发仪。
5.8氮吹仪。
5.9 固相萃取装置。
5.10鸡心瓶：100 mL.
5.11聚四氟乙烯离心管：50 mL。
5.12 滤膜：有机相，0.22μm。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1提取
称取试料5 g±0.05 g，于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加乙酸乙酯20 mL，涡动2 min，4 000 r/ min离心5 min，取上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣中加乙酸乙酯20 mL，重复提取一次，合并两次提取液。
7.2净化
鸡心瓶中加0.1 mol/L盐酸溶液4 ml，于40℃下旋转蒸发浓缩至少于3 mL，转至10 mL离心管中。用0.1 mol/L盐酸溶液2 mL洗鸡心瓶，转至同一离心管中。再用正已烷3 mL洗鸡心瓶，将正已烷转至同一离心管中，涡旋混合30 s，3 000 r/min离心5 min，弃正已烷。再次用正已烷3 mL洗鸡心瓶，转全同一离心管中，涡旋混合30 s，3 000 r/min离心5 min，弃正已烷，取下层液备用。
MCX柱依次用甲醇2mL和0.1mol/L盐酸溶液2mL活化，取备用液过柱，控制流速1mL/min.
依次用0.1mol/L盐酸溶液1mL和50%甲醇乙腈溶液2mL淋洗，用洗脱液4mL洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，加0.1%甲酸乙腈溶液1.0mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。
7.3 标准曲线制备
精密量取10μg/mL磺胺类药物混合标准工作液适量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀释，配制成浓度为10、50、100、250、500、2500和5 000 ug/L的系列混合标准瘩液，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.4 测定
7.4.1液相色谱参考 条件
7.4.1.1色谱柱 ：ODS-3C18(250 mmX4.5 mm，粒径5 μm) ，或相当者。
7.4.1.2 流动相：0.1%甲酸+乙腈，梯度洗脱见表1。
7.4.1.3流速：1 mL/ min。
7.4.1.4柱温：30 ℃。
7.4.1.5检测波：270 nm。
7.4.1.6进样体积：100 μL。
7.4.2测定法
取试样溶液和相应的对照溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。对照溶液及试样溶液中磺胺类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，对照溶液和试样溶液的高效液相色谱图见附录A。
7.5空白试验
除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
8结果计算和表述
试料中磺胺类药物的残留量按式(1)计算：
式中：
X——供试试料中相应的磺胺类药物的残留量，单位为微克每千克(μg/kg);
c——试样溶液中相应的磺胺类药物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V——溶解残余物所用0.1%甲酸乙腈溶液体积，单位为毫升(mL);
m——供试试料质量，单位为克(g)。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9检测方法灵敏度准确度和精密度
9.1 灵敏度
本方法猪和鸡的肌肉组织的检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg;猪和鸡的肝脏组织的检测限为12 μg/kg ，定量限为25 μg/kg. .
9.2 准确度
本方法肌肉组织在10 μg/kg~200 μg/ kg、肝脏组织在25 ug/kg~200 μg/kg浓度添加水平上的回收率为60%~120%。
9.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
