中华人民共和国国家标准
农业农村部公告第197号-9-2019
畜禽血液和尿液中150种兽药及其它化合物鉴别和确认
液相色谱-高分辨串联质谱法
前言
本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。
请注意本文件某些内容可能涉及专li。本文件的发布机构不承担识别这些专li的责任。
本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）归口。
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。
本标准主要起草人：杨曙明、徐贞贞、王雪、陈爱亮、赵燕、邱静。
1范围
本标准规定了猪血、牛血、羊血和鸡血以及猪尿、牛尿、羊尿中150种兽药及其他化合物的液相色谱-高分辨串联质谱鉴别和确认方法。
本标准适用于猪血、牛血、羊血和鸡血以及猪尿、牛尿、羊尿中150种兽药及其他化合物的鉴别和确认，其他畜禽血液和尿液可参照执行。
150种兽药及其他化合物的检出限参见附录A。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的可用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 1897动物及动物产品兽药残留监控抽样规范
3原理
血液和尿液中的兽药及其他化合物可在弱酸性条件下用乙腈提取，经QuEChERS方法净化后，利用液相色谱高分辨串联质谱（UHPLC-Q-TOF）进行鉴别和确认。
4试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
4.1水：GB/T 6682，一级水
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲酸：色谱纯。
4.5乙酸铵：色谱纯。
4.6柠檬酸：色谱纯。
4.7 50%甲醇溶液：取10.0 mL甲醇，用水定容至20 mL配制50%甲醇水溶液。
4.8 2mol/L乙酸铵溶液：称取15.42 g乙酸铵，用水定容至100 mL。
4.9 流动相A：分别准确量取2 mL甲酸和1 mL乙酸铵溶液（4.8），置于1000 mL容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。
4.10流动相B：准确量取2mL甲酸，用甲醇定容至1000mL。
4.11 EDTA-McIIvaine缓冲液： 分别称取无水磷酸氢二钠10.9g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）3g，柠檬酸12.9 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
4.12 150种兽药及其他化合物标准物质纯度、分类及推荐溶剂：参见附录B。
4.13混合标准储备液（100μg/mL）
参照附录B的分组，分别精密称取150种兽药及其他化合物的标准品适量，并用其推荐的溶剂配制成15组混合标准储备液，其中A组（15种）、B组（16种）、C组（12种）、D组（9种）、E组（2种）、F组（9种）、G组（28种）、H组（16种）、I组（10种）、J组（6种）、K组（3种）、L组（6种）、M组（7种）、N组（5种）、O组（6种）。A组、B组、C组、D组、G组、H组、J组、K组、L组、O组10组可在-20℃以下保存12个月；其他5组标准品-20℃以下保存2 个月。
4.14混合标准工作液（100 ng/mL）
准确量取各组混合标准储备液（4.13）适量，用50%甲醇溶液（4.7）稀释、制备。该溶液需临用现配。
4. 15 QuEChERS 盐析包：每份含4 g硫酸钠及1 g氯化钠。
4. 16除脂分散净化剂 [QuEChERS dSPE EMR-Lipid（5982-1010）]。
5仪器设备
5.1液相色谱高分辨飞行时间质谱：配有电喷雾离子源。
5.2分析天平感量 0. 0001 g和0.01 g。
5.3涡旋混合仪。
5.4离心机：转速不低于 9500 r/min。
5.5氮吹仪。
5.6微孔滤膜：0. 22 μm。
6样品
按NY/T 1897的规定进行取样。以不含待测兽药及其他化合物样品为空白样品。所采集样品应在-20℃以下保存。试验前取适量恢复至室温的样品，混匀备用。
7试验步骤
7.1提取
平行做2份实验，准确移取试样2 mL至50 mL离心管中，加入3 mL EDTA-McIIvaine缓冲液（4.11），涡旋混匀，再加入10.0mL乙腈，涡旋1min后加入1份萃取盐包（4.15），静置10min盐析分层，9500 r/ min条件下离心10 min，准确量取8 mL的上层清液（相当于1.6 mL试样量）于15 mL离心管中，在40℃下，氮吹至约2 mL，备净化用。
7.2 净化
称取含0.5g除脂分散净化剂（4.16）于净化管，加入2mL水，混匀、活化后，将净化剂转移至7.1得到的待净化试样溶液中，涡旋1min，在9500r/min条件下离心5min，上清液过滤膜，供UHPLC-Q-TOF分析测定。
7.3参考液相色谱条件
色谱柱：C18柱，长度150mm，内径3.0mm，粒径1. 8μm，如Zorbax Eclipse Plus或性能相当者。
柱温：40℃。
流速：0.4 mL/ min。
进样量：2μL。
梯度洗脱条件见表1。
7.4 参考质谱条件
离子源：电喷雾离子源
扫描方式：正离子模式（ESI+ ）。
碎裂电压：125 V。
干燥气温度：250℃。
干燥气流速：7 L/min。
雾化气压力：35psi。
毛细管电压：3000V。
喷嘴的电压：200 V。
采集模式：Scan MS及Target MS/MS。
Scan MS/MS模式监控窗日：10 ppm；扫描范围：50m/z~1300m/z。
Target MS/MS模式监控窗口：15 ppm，扫描范围：50m/z-1000m/z。
采集频率：2 spectra/s。
参比离子：121.050 873、922.009798。
分辨率> 45 000（2722m/z）；分辨率＞25000（322m/z）。
7.5高分辨质谱谱库建立
输入150种兽药及其他化合物的中英文名称、CAS号及化学式，由高分辨质谱谱库构建软件计算得到每个化学品的理论质量数。利用100ng/mL的混合标准工作溶液在MS San模式下进行测定，得到每个兽药及其他化合物的保留时间和母离子精确质量数测定值；在Target MS/MS模式下，对每种兽药及其他化合物进行碎片离子谱图采集并将其导入高分辨质谱谱库，与相应化学品的保留时间（参见附录C）、精确质量数测定值、中英文名称、CAS号、分子式等信息相关联，完成谱库构建。
7.6 鉴别
鉴别分析依据MS Scan模式下保留时间及精确质量数测定值。如检出的色谱峰保留时间与谱库中的保留时间偏差在±2.5%之内，且母离子精确质量数与理论质量数的偏差小于或等于5 ppm，则可以初步判断试样中含有该种兽药或相关化合物。
7.7 确认
对于初步鉴别出的阳性yao物，在Target MS/MS模式下检测其在不同碰撞能下典型的二级碎片离子（参见附录A），如果至少有2个及以上丰度较高的碎片离子与谱库中相应的碎片离子质量数偏差小于10ppm，且上述二级碎片离子与浓度接近的标准工作液中对应的碎片离子的相对丰度一致，即偏差不超过表2规定的范围，且平行试验结果-致的情况下，可判定为试样中存在这种兽药或化合物。
