中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4655-2016
出口食品中草甘膦及其代谢物残留量的测定方法
液相色谱-质谱/质谱法
前言
本标准按照GB/T 1.1- 2009 给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专li。本文件的发布机构不承担识别这些专li的责任。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、宁波出入境检验检疫局、福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：徐敦明、陈树兵、吴敏、杜凤君、余宇成、刘正才、张缙、张志刚。
1范围
本标准规定了出口食品中草甘膦及其代谢物（氨甲基磷酸）残留量的液相色谱质谱/质谱测定方法。
本标准适用于茶叶、小麦、玉米、稻谷、甘蔗、大豆、柑橘、苹果、桃、葡萄、香蕉、西瓜、大麦茶、棉籽油中草甘膦及其代谢物残（氨甲基磷酸）残留量的检测和确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样用水提取，经透析袋、RP柱及石墨化碳黑吸附剂净化，用液相色谱质谱/质谱仪测定，外标法定量。
4试剂材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一-级水。
4.1甲 醇，色谱纯。
4.2乙腈，色谱纯。
4.3乙酸铵，色谱纯。
4.4乙 酸铵溶液（5 mmol/L，pH：10~11）：准确称取3.855g（精确至0.0001 g）乙酸铵，用水定容至50 mL，配制成1 mol/L乙酸铵溶液：再取其中5 mL，用水定容至1 000 mL，氨水调节pH至10~11。
4.5标准物质：草甘膦（ glyphosate，GLY ，CAS：1071-83-6），纯度≥98.0%；氨甲基磷酸（ aminomethyl phosphonic acid， AMPA，CAS：1066-51-9），纯度≥98.0%。
4.6 透析袋：直径22 mm，压平宽度（半周长）34 mm，截留分子量3500 Da。
4.7标准品溶液的配制：准确称取GLY和AMPA标准品各10 mg，用水定容至10 mL，配置成浓度为1mg/mL的标准储备溶液。
4.8 标准储备的配制：吸取标准品溶液，用水稀释，分别配制成浓度为10μg/mL的标准储备液。
4.9标准工作溶液的配制：根据需要，临用时吸取一-定量的标准储备液，用水溶液稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。
4.10透析袋处理：用剪刀剪至 10 cm~20 cm小段，用水煮沸10 min，二次水洗净，保存至乙醇中；使用前后均用二次水清洗净。
4.11 OnGuard II RP柱（1.0 cc柱）：使用前5 mL甲醇、5 mL水活化，静置半小时；使用后甲醇清洗保存。
4.12石墨化碳黑吸附剂（GCB）：40μm~60μm，ProElut填料，或相当者。
4.13微孔滤膜：0.22μm，有机系，聚四氟乙烯（PTFE）膜。
5仪器与设备
5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
5.2 电子天平：感量分别为0.01 g，0.0001 g。
5.3组织捣碎机。
5.4 粉碎机。
5.5 均质器：15 000 r/min。
5.6 离心机：5 000 r/min以上。
5.7高 速离心机：15000 r/ min以上。
5.8 超声仪。
5.9 离心管：50 mL。
5.10 试管：50 mL
5.11注射器。
5.12涡漩混匀器。
5.13氮吹仪。
6试样制备与保存
6.1试样制备
6.1.1液体样品
液体样品混匀备用。
6.1.2果蔬类
取代表性样品约500 g，将其切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装入洁净容器，密封， 标明标记。
6.1.3粮谷类和茶叶类
取代表性样品约500g，用粉碎机粉碎，过20目筛，混匀，装入洁净容器，密封，标明标记。
6.2 试样保存
将试样于-5℃以下避光保存。
注：在抽样及制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
7分析步骤
7.1提取
液体样品、粮谷类、及果蔬样品称取试样4 g（精确到0.01 g），于50 mL离心管（5.9）中，加入6 mL水，于高速（15000 r/min）均质器（5.5）上均质3 min，以15 000 r/min离心（5.7）5 min，收集水相，用水定容至10 mL。
茶叶类样品称取试样2 g（精确到0.01 g），于 50 mL离心管（5.9）中，加入10 mL水，于高速（15000 r/ min）均质器（5.5），上均质3 min，将离心管以15000 r/ min离心（5.7）5 min，收集上层液，用水定容至10 mL。
7.2 净化
取样品提取液10 mL加入经活化了的透析袋（4.10）中，并将透析袋置于已加入10 mL水的50 mL试管（5.10）中，超声（5.8）1 h。取出透析袋，从玻璃管中取出5 mL残液，用5 mL注射器（5.11）注入已活化的RP柱（4.11），弃去RP柱前2 mL流出液，用5 ml离心管收集后3 mL流出液；加入20 mg。
GCB（4.12），旋窝震荡2 min后于15000 r/min离心5 min，取2 ml上清液至洁净的玻璃管中60℃下氮吹（5.13）至干，残渣用0.5 mL的水溶液溶解，过聚四氟乙烯（PTFE）膜，供液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS）分析。
7.3测定
7.3.1液相 色谱-质谱/质谱条件
液相色谱-质谱/质谱条件如下：
a） 色谱柱：NH2P-50 2D柱长150 mm，内径2.0 mm，粒径5μm或相当者；
b）流动相：A：5 mmol/L乙酸铵水溶液（氨水调pH10~11），B：乙腈溶液；流速：0.25 mL/ min，梯度洗脱程序见表1；
c） 柱温：35℃；
d） 进样量：10μL； .
e） 离子源：电喷雾（ESI）；
f） 扫描方式：负离子；
g） 监测方式：多反应监测MRM）；
h） 质谱条件参见附录A。
7.3.2色谱测定
7.3.2.1定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，样品的质量色谱峰保留时间与标准品中对应的保留时间一致；且样品中各组分定性离子的相对丰度与接近浓度的标准工作溶液中相应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。
7.3.2.2定量测定
在仪器最佳工作条件下，对标准工作溶液进样。用标准工作曲线按外标法定量，样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果待测物含量超过线性范围，则重新取样分析，用水稀释到线性范围内后分析。在上述色谱条件下GLY和AMPA的参考保留时间约为4.68min和4.20min，标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。
7.4空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
8结果计算和表达
结果用色谱数据处理机或按式（1）计算试样中草甘膦和氨甲基磷酸的残留量：
式中：
X——试样中草甘膦或氨甲基磷酸残留含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c——标准工作溶液中草甘膦或氨甲基磷酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样称取质量，单位为克（g）。
注：计算结果应扣除空白值。
9测定低限和回收率
9.1 测定低限
本方法对草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定低限均为50rg/kg。
9.2回收率
不同添加浓度范围内回收率的实验数据，见表3。
