GB 31658.9-2021 食品安全国家标准
动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件系首ci发布。
1范围
本文件规定了猪、牛、羊、鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏和脂肪），鸡蛋，牛奶，羊奶，猪尿和牛尿中雌激素类药物（雌三醇、雌酮、炔雌醇、17a-雌二醇17β-雌二醇、已烯雌酚、已烷雌酚和己二烯雌酚）残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊、鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏和脂肪），鸡蛋，牛奶，羊奶，猪尿和牛尿中雌激素类药物（雌三醇、雌酮、炔雌醇、17a-雌二醇17β-雌二醇、已烯雌酚、已烷雌酚和己二烯雌酚）残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文作；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的药物经酶解后用乙腈提取，必威首页登录平台官网
净化。液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯、水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2甲醇（CH3OH）。
5.1.3氢氧化钠（NaOH）。
5.1.4 正已烷（C6H14）。
5.1.5 二氯甲烷（CH2Cl2）。
5.1.6氯化钠（NaCl）。
5.1.7 乙酸铵（CH3COONH4）。
5.1.8 乙酸（CH3COOH）。
5.1.9 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（β-glucuronidase/arylsulfatase） ：β-葡萄糖醛酸酶4.5 U/mL，芳基硫酸酯酶14 U/mL。
5.2溶液的配制
5.2.1二氯甲烷-甲醇溶液：取二氯甲烷70 mL、甲醇30 mL，混合。
5.2.2 甲醇-水溶液：取甲醇40 mL、水60 mL，混合。
5.2.3乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：取乙酸铵1.54 g，加水溶解并稀释至约800 mL，调节pH至5.2，稀释至1 000 mL，混匀。
5.2.4 40%乙腈溶液：取乙腈200 mL、水300 mI，混匀。
5.3标准品
雌三醇、雌酮、炔雌醇、17a-雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚雌三醇-D3、雌酮-D2、炔雌醇-D1、17a-雌二醇-D2、17β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8、己烷雌酚-D4和己二烯雌酚-D6，含量均≥95%，见附录A。
5.4标准溶液的制备
5.4.1标准储备液：取各雌激素类药物标准品、同位素标记标准品各10mg，精密称定，分别加乙腈适量使溶解并稀释至100 mL棕色容量瓶，制成浓度均为100μg/mL的标准储备液。-18℃保存，有效期12个月。
5.4.2混合标准储备液：分别准确移取雌三醇、雌酮、炔雌醇、17a-雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚标准储备液各5 mL，于100mL棕色容量瓶，用乙腈稀释至刻度。-18℃保存，有效期12个月。
5.4.3混合内标储备液：分别准确移取雌三醇-D3、雌酮-D2、炔雌醇-D4、17a-雌二醇-D2、17β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8、己烷雌酚-D4和己二烯雌酚-D6标准储备液各5mL，于100mL，棕色容量瓶，用乙腈稀释至刻度。-18℃保存，有效期12个月。
5.4.4 混合内标工作液：准确移取混合内标储备液0.2 mL于10 mL棕色容量瓶，用乙腈稀释至刻度。该溶液中各内标浓度为100μg/L。现用现配。
5.4.5混合标准工作液：准确移取混合标准储备液、混合内标工作液适量，用40%乙腈溶液稀释成浓度为1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、20μg/L、50μg/L和200μg/L的系列标准工作溶液，每一标准工作溶液含各内标浓度均为5.0μg/L。现用现配。
5.5 材料
5.5.1 HLB必威首页登录平台官网
：200mg/6mL，或相当者。
5.5.2氨基必威首页登录平台官网
：500mg/6mL，或相当者，使用前用二氯甲烷甲醇溶液6 mL活化。
5.5.3针头式过滤器（通用型滤膜）：尼龙材质，孔径0. 22μm或性能相当者。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配自动进样器和电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6. 4固相萃取装置。
6.5 离心管：聚丙烯塑料离心管，50 mL。
6.6 离心机：10000 r/min或以上。
6.7 pH计。
6.8 涡旋混合器。
7试料的制备与保存
7.1 试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。
a） 取均质后的供试样品，作为供试试料；
b） 取均质后的空白样品，作为空白试料；
c） 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
7.2 试料的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。
8测定步骤
8.1 提取
8.1.1 动物组织、牛奶、羊奶和鸡蛋
取试样5 g（准确至±0.05 g），于50 mL离心管，准确加入混合内标工作液50μL，混合15 s，加乙酸铵溶液10 mL、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL，涡旋1 min，盖盖子，（37±1）℃振荡酶解12h。取出，冷却至室温，加氯化钠4g，振摇溶解，加乙腈20mL，涡旋1min，10000r/min离心5min，取乙腈层，加乙腈15 mL，重复提取。合并2次提取液，加正己烷10 mL，涡旋1 min， 10 000 r/min离心2 min，取乙腈层，40℃氮吹至干，用甲醇1 mL溶解，再加水9 mL，备用。
8.1.2动物尿液
取试样5.00mL于50mL，离心管用乙酸调节pH至5.2，准确加混合内标工作液50μL，混合15s，加乙酸铵溶液10 mL、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL，后续提取步骤同8.1.1。
8.2 净化
取HLB必威首页登录平台官网
，依次用二氯甲烷-甲醇6mL、甲醇6mL和水6mL活化，取备用液，过柱，控制流速不超过2 mL/min，依次用甲醇-水3mL、水3mL淋洗小柱，抽干，再将活化过的氨基必威首页登录平台官网
串联在HLB必威首页登录平台官网
下方，用二氯甲烷-甲醇8mL洗脱收集洗脱液，取下HBL柱，再二氯甲烷-甲醇2mL洗氨基柱，合并洗脱液，40℃水浴氮气吹干，用40%乙腈溶液1.0ml溶解残渣，涡旋混匀，0.22μm 滤膜过滤，供液相色谱-串联质滥测定。
8.3标准曲线的制备
取1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、20μg/L、50μg/L和200μg/L的系列混合标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。以激素类药物与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和租关系数。
8.4 测定
8.4.1液相色谱参考条件
a） 色谱柱：C18色谱柱100mm×2.1mm，1.7μm，或相当者；
b） 流动相：A为水，B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
表1 流动相梯度洗脱条件
|
时间min
|
A%
|
B%
|
|
0
|
80
|
20
|
|
1.0
|
80
|
20
|
|
7.0
|
45
|
55
|
|
8.0
|
45
|
55
|
|
8.1
|
80
|
20
|
|
10
|
80
|
20
|
c） 流速：0.4mL/min；
d） 柱温：40℃；
e） 进样量：10μL。
8.4.2质谱参考条件
a） 离子源：电喷雾离子源；
b） 扫描方式：负离子扫描；
c） 检测方式：多反应监测（MRM）；
d） 毛细管电压：2.5 kV；
e） RF透镜电压：0.5 V；
f） 离子源温度：150℃；
g） 脱溶剂气温度 ：600℃；
h） 锥孔气流速：50L/h；
i） 脱溶剂气流速：1100 L/h；
j） 倍增器电压： 650 V；
k） 二级碰撞气：氩气；
l） 保留时间、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。
8.4.3 测定法
取混合标准工作液与试样溶液交替进样，作单点或多点校准，按内标法以色谱峰面积定量，每种雌激素选择对应的同位素内标物进行定量。试样溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。试样中待测物质的保留时间与相应内标物保留时间的比值与标准溶液中待测物质的保留时间与相应内标物保留时间的比值偏差在±2.5%之内，且样品中各组分的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液的相对离子丰度一致，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。标准工作溶液多反应监测色谱图见附录B。
8.5空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试料中待测药物的残留量按标准曲线或按公式（1）~公式（3）计算。
动物性食品中的残留量：
尿液中的残留量：
式中：
X——试料中雌激素类药物残留量的数值， 单位为微克每千克（μg/kg）或微克每升（μg/L） ；
C——试料溶液中雌激素类药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
Cis——试料溶液中雌激素类药物内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
Cs——标准溶液中雌激素类药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
C'is——标准溶液中雌激素类药物内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
Ai——试料溶液中雌激素类药物的峰面积；
Ais——试料溶液中雌激素类药物内标的峰面积；
As——标准溶液中雌激素类药物的峰面积；
A'is——标准溶液中雌激素类药物内标的峰面积；
V——定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试料质量的数值，单位为克（g）；
v——试料体积的数值，单位为毫升（mL）；
10检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法在猪、牛、羊、鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏和脂肪），鸡蛋，牛奶和羊奶中的检测限为0.50μg/kg，定量限为1. 0μg/kg；猪尿和牛尿中的检测限为0. 50μg/L，定量限为1.0μg/L。
10.2准确度
本方法在1μg/kg（L）~5μg/kg（L）添加浓度水平上的回收率为80%~ 130%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15% ，批间相对标准偏差≤20%。
