中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4259-2015
出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定
液相色谱-质谱_质谱法
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专li。本文件的发布机构不承担识别这些专li的责任。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：李建华、何强、孔祥虹、邹阳、张璐、李莹、付骋宇。
1范围
本标准规定了水果和蔬菜中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚四种链格孢菌毒素含量的液相色谱-串联质谱检测方法。
本标准适用于苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜、辣椒等样品中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚含量的测定和确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中的链格孢菌毒素用乙腈提取后，经聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物必威首页登录平台官网
串联氨基必威首页登录平台官网
净化，或凝胶渗透色谱仪（GPC）结合氨基必威首页登录平台官网
净化，用液相色谱-串联质谱仪进行测定和确证，外标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1乙腈：HPLC级。
4.2甲醇：HPLC级。
4.3二氯甲烷。
4.4乙酸乙酯。
4.5环已烷。
4.6甲酸。
4.7氯化钠。
4.8 无水硫酸钠：650℃灼烧4 h，贮于密封容器中备用。
4.9乙酸乙酯-环己烷（1+1，体积比）：量取1000mL乙酸乙酯与100 mL环已烷混合均匀。
4.10甲醇-水溶液（1+4，体积比）：量取 100mL甲醇与400mL水混合均匀。
4.11 甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（0.5 +50+ 50，体积比）：量取100mL甲醇、100mL乙酸乙酯、1mL甲酸混合均匀。
4.12乙腈-水溶液（1+ 1，体积比）：量取100mL乙腈与100mL水混合均匀。
4.13链格孢莓素标准物质（Altenuene ，C15 H16O6，CAS：29752 -43-0）：纯度大于等于99.0%。
4.14链格孢酚标准物质（Alternariol，C14 H10O5，CAS：641-38-3）：纯度大于等于98.5%。
4.15腾毒素标准物质（Tentoxin，C22H30N4O4，CAS：28540-82-1）：纯度大于等于99.5%。
4.16链格孢酚甲醚标准物质（Alternariol monomethyl-ether，C15H12O5，CAS：26894-49-5）：纯度大于等于99.0%。
4.17标准储备溶液：准确称取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚，分别用乙腈制成100μg/mL的标准储备溶液，0℃~4℃保存。
4.18混合标准工作溶液：分别取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚标准储备液，根据需要用乙腈-水溶液（4.12）逐级稀释，配制成适当浓度的标准工作溶液。0℃~4℃保存。
4.19聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物必威首页登录平台官网
：HLB柱，60mg，3mL或相当者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化，保持柱体湿润。
4.20氨基必威首页登录平台官网
：500mg，3mL。使用前在柱上端装填约2cm高的无水硫酸钠（4.8），然后用5mI二氯甲烷活化，保持柱体湿润。
4.21微孔滤膜：0.2μm，有机系。
5仪器和设备
5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有ESI电离源串联四级杆质量分析器。
5.2凝胶渗透净化系统。
5.3 分析天平：感量0.01mg、0.01g。
5.4 组织捣碎机。
5.5 振荡器。
5.6离心机：转速不低于3000 r/min。
5.7固相萃取装置，带真空泵。
5.8减压旋转蒸发器。
5.9 氮吹仪。
5.10 具塞离心管：50mL。
5.11浓缩瓶：50 mL、100mL
6试样制备与保存
取代表性样品约500g，将其可食用部分切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装入洁净的容器内，密闭并标明标记，于-18℃冷冻保存。
注：在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
7测定步骤
7.1 提取
7.1.1 苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜
称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入4 g氯化钠，10mL水，15mL乙腈，振荡提取10min，3 000r/min离心5min，将上层乙腈提取液转移到浓缩瓶中。再分别用15mL乙腈重复提取两次，合并乙腈提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用1.0mL甲醇溶解残渣，再用9.0mL水稀释，过滤，待净化。
7.1.2辣椒
称取5g（精确至0.01g）试样于50ml离心管中，加入4g氯化钠，10 mL水，15 ml乙腈，10 mL正已烷，振荡提取10min，3000r/min离心5min，用玻璃吸管移取中间的乙睛层于浓缩瓶中。再分别用15mL乙腈重复提取两次，合并乙腈提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用10.0mL乙酸乙酯-环己烷（4.9）溶解残渣，过滤，待净化。
7.2净化
7.2.1苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜
取提取液（7.1.1）5.0mL加入HLB必威首页登录平台官网
（4.19），待样品溶液流完后，保持柱体湿润，用5 mL甲醇-水（4.10）淋洗，减压抽干2min，将氨基桂（4.20）申接在HLB必威首页登录平台官网
下方，用5mL二氯甲烷淋洗，弃去淋洗液，再用7mL甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11）洗脱，整个净化过程保持2mL，/ min~3mL/min的流速，收集洗脱液，40℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙腈-水（4.12）溶解定容，过0.2μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。
7.2.2辣椒
取提取液（7.1.2）5.0mL用凝胶渗透色谱净化，收集洗脱液，于40℃减压蒸至近干，加入2mL二氯甲烷，过氨基柱（4.20）净化，用2mL二氯甲烷洗涤浓缩瓶.洗涤液一并过氨基柱，再用5mL二氯甲烷淋洗，弃去淋洗液，用7mL甲酸甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11）洗脱，整个净化过程保持2mL/ min~3mL/min的流速，收集洗脱液，40℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙腈水（4.12）溶解定容，过0.2μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。
凝胶渗透色谱净化参考条件：
a） 凝胶柱：内径25mm，柱长400mm，填料为Bio-Beads-S-X3 Beads（200 mesh~ 400 mesh），或相当者；
b） 流动相：乙酸乙酯-环已烷（4.9）；
c） 流速：5.0mL/min；
d） 进样量：5.0mL；
e） 收集方式：时间模式，收集19.0min~30.0min洗脱流出液。
7.3测定
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a） 色谱柱：C18柱，长50mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或相当者；
b） 流动相：乙腈-水梯度洗脱，参见表1，梯度变化模式为线性递增或递减；
c） 柱温：35℃；
d） 进样量：2.0μL。
7.3.2质谱参考条件
质谱检测参考条件参见附录A。
7.3.3液相色谱-串联质谱检测及确证
7.3.3.1 定量测定
根据样液中链格孢霉毒素含量情况，选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中链格孢霉毒素的响应值均应在仪器检测线性范围内，如果样液中链格孢霉毒素含量超出检测的线性范围，则稀释后再进样。对标准工作溶液和样液等体积分时段参插，进样测定，外标法定量，在7.3规定的色谱及质谱条件下，4种链格孢霉毒素标准品的液相色谱串联质谱选择性离子流图参见附录B中图B.1。
7.3.3.2定 性测定
对标准工作液及样液按7.3规定的条件进行测定时，如果样液与标准工作液的选择离子图中，样液中目标物质的保留时间与相近浓度标准溶液的保留时间偏差在±2.5%以内；且定性离子对的相对丰度与相近浓度标准溶液对应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
7.4空白试验
除不加试样外，均按上述检测步骤进行。
7.5结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式（1）计算试样中链格孢霉毒素含量。
式中：
X——试样中链格孢霉毒素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A——样液中链格孢霉毒素的色谱峰面积；
cS——标准工作液中链格孢霉毒素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
A——标准工作液中链格孢霉毒素的色谱峰面积；
m——最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。
8测定低限、回收率
8.1 测定低限
本方法中4种链格孢霉毒素的测定低限均为0.01mg/kg。
8.2 回收率
4种链格孢霉毒素的添加水平及回收率数据参见附录C中表C.1。
