中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3290-2018
水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的测定
液质联用法
1范围
本标准规定了水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的液质联用测定方法。
本标准适用于水果、蔬菜及其制品中14种主要酚酸的含量测定。
本标准的方法检出限和定量限见附录A。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8855 新鲜水果和蔬菜取样方法
3原理
水果、蔬菜及其制品中的酚酸经甲醇提取和碱性水解液提取处理得到游离型酚酸、游离酯型酚酸和结合型酚酸，经固相萃取小柱净化，超高效液相色谱柱分离，三重四级杆质谱检测，外标法定量。
4试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水
4.1 试剂
4.1.1盐酸（HCl）：优级纯。
4.1.2甲酸（HCOOH）：色谱纯。
4.1.3甲醇（CH3OH）：色谱纯。
4.1.4乙腈（CH3CN）： 色谱纯。
4.1.5氢氧化钠（NaOH）：优级纯。
4.1.6提取剂：甲醇+水+盐酸= 80+20+0.05（V+V+V），取800 mL甲醇（4.1.3）、200 mL水和
0.5 mL盐酸（4.1.1），混匀。
4.1.7 4mol/L氢氧化钠溶液：称取160.0g氢氧化钠（4.1. 5），用水溶解定容至1000 mL。
4.2标准品
14种酚酸标准品：纯度≥98% ，相关信息见附录A。
4.3标准溶液配制
4.3.1酚酸标准储备液：称取酚酸标准品10.00mg，用甲醇（4.1.3）溶解并定容至10mL，配制成1mg/mL的各酚酸标准储备液，在-20℃保存，可使用12个月。
4.3.2酚酸混合标准溶液：根据需要，准确吸取一定量的各酚酸标准储备液，用甲醇（4.1. 3）稀释成适当浓度的混合标准溶液，现用现配。
4.4 材料
4.4.1有机相微孔滤膜：0. 22μm。
4.4.2固相萃取小柱：Oasis HLB固相萃取小柱，200 mg，6 mL，或性能相当者。
5仪器
5.1液相色谱仪：配有三重四级杆质谱检测器。
5.2电子天平：感量为0.01g和0. 0001g。
5.3离心机：可达到9000r/min以上。
5.4振荡器：带有温度控制。
5.5超声波清洗器。
5.6旋转蒸发仪：带有温度控制。
6试样的制备
水果、蔬菜及其固体制品按GB/T 8855的规定取样，四分法取约250 g，将可食部分切碎，立即用液氮冷冻，研磨成粉末，备用。液体果蔬制品直接混匀备用。
7分析步骤
7.1 提取
称取10.00 g试样于50 mL棕色离心管中，加入30 mL提取剂（4.1.6） ，混匀，室温下超声20 min，9000 r/ min离心5 min，上清液转入50 mL棕色容量瓶中，残渣再用约10 mL提取剂（4.1.6）按上述步骤重复提取一次，合并两次提取液，用提取剂（4.1. 6）定容至50 mL用于游离型酚酸和游离酯型酚酸的制备，残渣用于结合型酚酸的制备。
7.2酚酸的制备
7.2.1游离型酚酸的制备
吸取10.00mL样品提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，40℃下减压蒸发除去提取液中的有机溶剂，浓缩至近干，加入2 mL水，播匀，备用，即为溶液A。将固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5 mL甲醇（4.1. 3）和约5 mL水预淋洗、活化，将溶液A加到固相萃取小柱中，缓慢抽滤，滤液需呈滴状，弃去滤液，用2mL水清洗旋转蒸发瓶，转入固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液，用约5mL甲醇（4.1.3）分两次，清洗旋转蒸发瓶，加入到固相萃取小柱中，收集滤液，用甲醇（4.1. 3）定容至5 mL，混匀，过滤膜（4.4.1）待测。
7.2.2游离酯型酚酸的制备
吸取10.00mL样品提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，40℃下减压蒸发除去提取液中的有机溶剂，浓缩至近干，用10 mL 4mol/L氢氧化钠溶液（4.1. 7）分三次清洗旋蒸瓶，清洗液合并到50 mL棕色离心管，40℃避光振荡水解2 h，用盐酸（4.1. 1）调节pH至2，混匀，备用，即为溶液B。将固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5mL甲醇（4.1.3）和约5mL水预淋洗、活化，将溶液B加到固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液，用约5mL甲醇（4.1.3）分两次清洗离心管，加入到固相萃取小柱中，收集滤液，用甲醇（4.1. 3）定容至5 mL，混匀，过滤膜（4.4. 1）待测。
7.2.3 结合酯型酚酸的制备
残渣（7.1）用30 mL提取剂（4.1. 6）分两次清洗后，用20 mL 4mol/L氢氧化钠溶液（4.1. 7）清洗到50 mL棕色离心管中， 40℃避光振荡水解2 h，离心吸取10 mL，用盐酸（4.1.1）调节pH至2为溶液C。将固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5 mL甲醇（4.1. 3）和约5 mL水预淋洗、活化，将溶液C加至固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液，用约5 mL甲醇（4.1. 3）分2次清洗固相萃取小柱，加入到固相萃取小柱中，收集滤液，用甲醇（4.1.3）定容至5 mL，混匀，过滤膜（4.4. 1）待测。
7.3 试剂空白试验
除不加入样品外，其他过程与样品处理相同。
7.4 测定
7.4.1液相色谱-串联质谱参考条件
色谱柱Waters HSS T3色谱柱，柱长150 mm，内径2.1 mm，颗粒度1.8μm，连接同款保护柱或性能类似的色谱柱。
流速：0.3 mL/ min。
流动相：A相为0. 1%甲酸，B相为乙腈（含0. 1%甲酸），流动相梯度洗脱程序见表1。
表1流动相梯度洗脱程序
|
时间min
|
流动相A
|
流动性B
|
|
0.00
|
95
|
5
|
|
0.50
|
95
|
5
|
|
5.00
|
70
|
30
|
|
9.5
|
10
|
90
|
|
10
|
95
|
5
|
|
15
|
95
|
5
|
柱温：40℃。
进样量：5μL。
电离源模式：电喷雾离子化。
电离源极性：负离子模式和正离子模式。
雾化气：氮气。
碰撞气（高纯氩气）流速：0.13 mL/min。
离子源温度：150℃。
脱溶剂气温度：500℃。
脱溶剂气流量：800 L/h。
监测离子对碰撞气能量和源内破碎电压参见附录B。
7.4.2定性测定
在相同试验条件下进行样品测定时样品检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且扣除背景后的样品质谱图中，所选离子均出现，且所选的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（表2），则可判断为该成分。试剂空白（7.3）同样进样测定。试剂空白不能检出有对被测组分有干扰的物质。各目标化合物的多反应监测（MRM）色谱图参见附录C。
表2 质谱选择离子丰度允许偏差
单位为百分率
|
相对丰度
|
＞50
|
＞20~50
|
＞10~20
|
≤10
|
|
允许偏差
|
≤±20
|
≤±25
|
≤±30
|
≤±50
|
7.4.3 定量测定
标准采用外标-校准曲线法定量测定。保证所测样品中组分的响应值均在仪器的线性范围内。
8结果计算
样品中待测组分的含量以质量分数计，以毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）表示，按式（1）计算。
式中：
X——试样中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/ kg）或毫克每升（mg/L）；
ρ——标准曲线计算出试样提取溶液中各组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——试样提取液定容体积， 单位为毫升（mL）；
m——所取试样的量，单位为克（g）或毫升（mL）；
计算结果保留到小数点后两位。
9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。
在再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
