中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 0162-2011
代替SN 0162-1992
出口水果中甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、
苯菌灵、噻菌灵残留量的检测方法
高效液相色谱法
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定起草。
本标准是对SN 0162-1992《出口水果中甲基托布津残留量检验方法》的修订，与
SN 0162-1992相比主要变化如下：
——文本结构不同：SN 0162-1992 按GB/T 1.1-1987编写，本标准按GB/T 1.1-2009 编写；
——检测物质增多：SN 0162-1992 只有甲基硫菌灵，本标准增加了硫菌灵、多菌灵、苯菌灵和噻菌灵；
——检测对象增多：SN 0162- 1992只有柑橘，本标准增加了苹果、梨、桃子和葡萄；
——删除SN 0162-1992的抽样内容（SN 0162-1992“2 抽样和制样”）；
——增加了试样制备与保存（见本标准“6 试样制备与保存”）；
——检测方法不同：SN 0162-1992采用气相色谱法，本标准采用高效液相色谱法；
——增加了测定低限、回收率（见本标准“8测定低限、回收率”）。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准由中华人民共和国湖南出入境检验检疫局负责起草。.
本标准主要起草人：王美玲、张莹、黄志强、胡宇东、李拥军、焦艳娜、颜鸿飞。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
——SN 0162-1992。
1范围
本标准规定了出口水果中甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、苯菌灵、噻菌灵残留量的高效液相色谱检测方法和液相色谱-质谱/质谱确证方法。
本标准适用于出口柑橘、苹果、梨、桃子和葡萄中甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、苯菌灵、噻菌灵残留量的测定和确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
用乙腈提取试样中残留的农药，经固相萃取小柱净化后，采用高效液相色谱法检测，外标法定量，液相色谱-质谱/质谱法确证。
4试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的- -级水。
4.1乙腈：液相色谱级。
4.2 甲醇：液相色谱级。
4.3甲苯。
4.4乙酸。
4.5氯化钠。
4.6氢氧化钠。
4.7氢氧化钠溶液（0.5 mol/L） ：称取2.0 g氢氧化钠，用水溶解并定容至100 mL。
4.8 0. 1%乙酸甲醇溶液：取1 mL乙酸，用甲醇稀释并定容至1 000 mL。
4.9 甲苯-乙腈（1+3，体积比）：量取100 mL甲苯，加入300 mL乙腈，混匀。
4.10甲醇-水（1+1，体积比）：量取100 mL甲醇，加入100 mL水，混匀。
4.11标准物质：甲基硫菌灵（thiophanate-methyl，CAS号：23564-05-8）、硫菌灵（thiophanate，CAS号：25564-06-9）、多菌灵（carbendazim，CAS号：10605-21-7）、噻菌灵（thiabendazole，CAS号：148-79-8）。
4.12标准贮备液：分别准确称取适量的上述标准品，用甲醉配制成1.0 mg/mL的标准贮备液。多菌灵需先用少量盐酸溶解后，再用甲醇溶解定容。-18℃下避光保存。
4.13混合标准中间液：分别准确移取1.0mL单个农药的标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的混合标准中间液，-18℃下避光保存。
4.14标准工作溶液；根据需要，临用时吸取一定量的混合标准中间液，用甲醇-水（4.10）稀释配成适当浓度的混合标准工作溶液。
4.15 石墨化碳氨基复合小柱：6 mL，500 mg或相当者。
4.16滤膜；有机系，0. 45μm。
5仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪，配紫外检测器。
5.2 高效液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
5.3 捣碎机。
5.4 涡旋混匀器。
5.5 离心机（最大转速10000 r/min）。
5.6 固相萃取装置。
5.7旋转蒸发仪。
5.8 氮气吹干仪。
5.9 电子天平：感量为0.0001号和0.01 g。
5.10 塑料离心管：50 mL，具塞。
5.11 尖嘴刻度离心管：5 mL。
6试样制备与保存
6.1试样制备
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分绞碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，标明标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6.2 试样保存
将试样于-18℃保存。
7测定步骤
7.1提取
称取5 g（精确至0.01 g）经捣碎样品于50 mL塑料离心管中，加入3 mL水，于涡旋混匀器上混合：1 min，再加入适量氢氧化钠溶液（4. 7），使试液的pH调至7~8，并加入2.0 g氯化钠，于混匀器上混匀。先用10 mL乙腈提取一次，涡旋混合3 min，以5000 r/min离心2 min。取上层清液于另一25 mL离心管中，残渣再加入10 mL乙腈，重复提取一次，合并上清液。提取液在氮气吹干仪上40℃下浓缩至近1 mL。加入0.5 mL乙酸甲醇溶液（4.8）混匀，准备过柱净化。
7.2 净化
将石墨化碳氨基复合小柱连接到固相萃取装置，用6 mL甲苯-乙腈溶液（4.9）预淋洗后，加入上述提取液（7.1），控制流速为0.5 mL/min，并用20 mL甲苯-乙腈溶液（4. 9）洗脱。收集所有流出液，在旋转蒸发仪上40℃下浓缩至近1 mL后，转移至尖嘴刻度离心管中，并用2 mL乙腈洗涤旋转蒸发瓶2次，合并洗涤液，在氮气吹干仪上40℃下浓缩至近0.5 mL，用甲醇水溶液（4.10）定容至1.0 mL，过0.45μm有机相微孔滤膜后，供高效液相色谱仪测定。
7.3 测定
7.3.1 液相色谱条件
7.3.1.1 色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm（内径），粒度5μm，端基封尾或相当者。
7.3.1.2 流动相：梯度洗脱程序见表1。
7.3. 1.3流速：1.0 mL/min。
7.3.1.4检测波长：276 nm。
7.3.1.5柱温：30℃。
7.3.1.6进样量：20μL。
7.3.2色谱测定
按照上述检测条件测定样液和混合标准工作溶液。以色谱峰面积按外标法定量。在上述色谱条件下待测物的参考保留时间分别为7.03 min（多菌灵）、8.55 min（噻蘭灵）、9.32 min（甲基硫菌灵）、13.32 min（硫菌灵）。标准溶液的液相色谱图参见图A.1。
7.4空白试验.
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
7.5结果计算和表述
用色谱数据处理机或按照式（1）计算样品中待测物的残留量，计算结果需扣除空白。
式中：
Xi——试样中某农药组分的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
Ai——样液中某农药组分的峰面积；
ci——标准工作溶液中某农药组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
Ais——标准工作溶液中某农药组分的峰面积；
m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。
注：苯菌灵在分析过程中已分解成多菌灵，故：
a） 当样品只施用苯菌灵农药时，苯菌灵定量结果以多菌灵计；
b） 当样品只施用多菌灵农药时，与多菌灵标液比对可得多菌灵定量结果；
c） 当样品同时施用苯菌灵和多菌灵农药时，苯菌灵+多菌灵合量结果以多菌灵计；
d） 检测甲基硫菌灵、硫菌灵农药残留时，需同时检测多菌灵。
7.6阳性样品的确证
7.6.1确证方法
对于高效液相色谱法检出的阳性样品，用液相色谱-质谱/质谱法进行定性确证。
7.6.2液相色谱 条件
7.6.2.1色谱柱：C18柱，150 mm×4.6 mm（内径） ，粒度5μm，端基封尾或相当者。
7.6.2.2流动相：梯度洗脱程序见表1。
7.6.2.3流速：0. 5mL/ min。
7.6.2.4柱温：30℃。
7.6.2.5进样量：10μL。
7.6.3 质谱条件
7.6.3.1离子源：电喷雾离子源。
7.6.3.2扫描方式：正离子。
7.6.3.3检测方式：多反应监测（MRM）。
7.6.3.4 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件见附录B。
7.6.3.5喷雾电压、去集簇电压、碰撞能量等参数应优化至最（zui）优灵敏度，参考条件见附录B。
7.6.4定性确证结果的判定
在相同的实验条件下，样液中被测物的质量色谱峰保留时间与标准工作液相同，并且在扣除背景后的样液谱图中，所选择的离子对均出现，各定性离子的相对丰度与标准品离子的相对丰度相比，误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。在上述色谱和质谱条件下，标准溶液的多反应监测色谱图参见图C.1。
8测定低限、回收率
8.1测定低限
甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、苯菌灵和噻菌灵的测定低限均为0.05mg/kg。
8.2回收率
不同样品基质添加浓度及回收率数据见表3~表7。
