中华人民共和国国家标准
GB/T 41133-2022
番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的测定
超高效液相色谱法
Determination of lycopene， lutein and carotene in tomato products-
Ultra performance liquid chromatography（UPLC） method
前言
本文件按照GB/T1.1--2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（SAC/TC 374）提出并归口。
本文件起草单位：上海市质量监督检验技术研究院、中检华纳（北京）质量技术中心有限公司、华纳通标（北京）认证有限公司。
本文件主要起草人：翁史昱、林琳、林毅侃、黄雨晴、张雯、郑翌、葛宇、陈羽菲、孟杰、郑存哲。
1范围
本文件规定了超高效液相色谱法测定番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的原理、试剂和材料、仪器设备、分析步骤、结果计算、精密度、检出限和定量限。
本文件适用于番茄粉、番茄酱、番茄饮料、番茄干制品中番茄红素、叶黄素、a-胡萝卜素和β-胡萝卜素的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样加入水和乙醇后，用乙醚-正己烷-环己烷混合溶液提取其中的番茄红素、叶黄素、胡萝卜素，超高效液相色谱法分离，紫外检测器或者二极管阵列检测器检测，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有规定，仅使用色谱纯试剂。
5.1水：GB/T 6682，一级。
5.2环己烷（C6H12）。
5.3 乙醚[（C2H5）2O]。
5.4正己烷（C6H14）。
5.5无水乙醇（C2H5OH）：分析纯。
5.6二丁基羟基甲苯（C15H24O，BHT）：分析纯。
5.7甲醇（CH3OH）。
5.8二氯甲烷（CH2Cl2）。
5.9萃取溶剂：用分析天平（6.3）称取1.0 g BHT（5.6）.以400 mL正己烷（5.4）溶解，加入200 mL环己烷（5.2）和400 mL乙醚（5.3），混匀。
5.10 0.1 % BHT和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）称取1.0 g BHT（5.6），加入1 000 ml二氯甲烷（5.8）混匀。
5.11 0.1 % BHT、乙醇和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）称取1.0 g BHT（5.6），以900 mL乙醇（5.5）溶解，加100 mL二氯甲烷（5.8）混匀。
5.12 番茄红素标准物质（C40H56，CAS号：502- 65 -8）：纯度大于或等于98%。
5.13叶黄素标准物质（C40H56O2，CAS号：127-40-2）：纯度大于或等于98%。
5.14 a-胡萝卜素标准物质（C40H56，CAS 号：7488-99-5）：纯度大于或等于98%。
5.15 β-胡萝卜素标准物质（C40H56，CAS号：7235-40-7）：纯度大于或等于98%。
5.16 番茄红素储备液（50μg/ml）：用分析天平（6.3）准确称取5 mg（精确至0.01 mg）番茄红素（5.12），以0.1% BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 mL。该标准储备液应充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期3个月。番茄红素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.17 叶黄素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5 mg（精确至0.01 mg）叶黄素（5.13），以0.1% BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 mL。该标准储备液应充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。叶黄素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.18 a-胡萝卜素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5 mg（精确至0.01 mg）a-胡萝卜素（5.14），以0.1% BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 mL。该标准储备液应充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。a-胡萝卜素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.19 β-胡萝卜素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5 mg（精确至0.01 mg）β-胡萝卜素（5.15），以0.1% BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 mL。该标准储备液应充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。β-胡萝卜素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.20混合标准工作液：分别从番茄红素储备液（5.16）、叶黄素储备液（5.17）、a-胡萝卜素储备液（5.18）和β-胡萝卜素储备液（5.19）中各准确移取0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL、0.400 mL、1.00 ml溶液于5个25 mL棕色容量瓶中，用0.1% BHT、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）定容至刻度，得到质量浓度为0.100μg/ mL、0.200μg/ mL、0.400μg/ mL、0.800μg/mL、2.00μg/mL的系列混合标准工作液。临用前配制。
5.21中性氧化铝固相萃取小柱：500 mg/3 mL，使用前用5 mL萃取溶剂（5.9）淋洗，保持柱体湿润。
5.22 0.22μm滤膜：有机系。
6仪器设备
6.1超高效液相色谱仪：配有二元及以上梯度泵，带二极管阵列检测器或紫外检测器。
6.2紫外分光光度计。
6.3分析天平：感量为0.01 mg和0.01 g。
6.4组织捣碎机。
6.5 涡旋振荡器。
6.6减压浓缩装置。
6.7固相萃取装置。
6.8离心机：转速不低 于5 000 r/min。
7试验步骤
7.1 通则
除非另行说明，所有试验操作应在500nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行；提取过程应在通风柜中操作。
7.2样品前处理
7.2.1试样制备
取一定数量的有代表性的样品，块状或颗粒状样品用组织捣碎机（6.4）粉碎，粉末状、糊状或液体样品充分混匀后，储存于样品瓶中。制备好的试样应充氮密封后置于-20℃或以下的冰箱中保存。
7.2.2试样提取
用分析天平（6.3）称取5 g（精确到0.01 g）试样（7.2.1）于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水（5.1），混匀，加入10 mL无水乙醇（5.5），15 mL萃取溶剂（5.9）于避光条件下用涡旋振荡器（6.5）提取3 min后，用离心机（6.8）5 000 r/min离心3min，吸取上清液于另一50 mL，聚丙烯离心管中，在原离心管中加入15 mL萃取溶剂（5.9）再次萃取，重复提取2次，合并提取液，用减压浓缩装置（6.6）在室温下浓缩至近干，在涡旋振荡器（6.5）上用5mL萃取溶剂（5.9）溶解残渣，待净化。
7.2.3试样净化
于固相萃取装置（6.7）中将提取液（7.2.2）以约1 mL /min的流速过已活化的中性氧化铝固相萃取小柱（5.21），用5 mL萃取溶剂（5.9）洗脱，合并流出液与洗脱液，用减压浓缩装置（6.6）在室温下浓缩至近干，在涡旋振荡器（6.5）上用2 mL 0.1% BHT、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）溶解残渣，过0.22 μm滤膜（5.22），待用。
7.3超高效液相色谱条件
超高效液相色谱仪（6.1）的色谱条件如下：
a）色谱柱：多环芳烃分析用 C18色谱柱，1.8 μm，100 mm×2.1 mm（内径）；
b）流动相A：甲醇（5.7）+二氯甲烷（5.8）（97：3）；流动相B：水（5.1），洗脱梯度应符合表1的规定；
c）柱温：30℃；
d）流速：0.4 mL/min；
e）进样量：2μL；
f）检测波长：450 nm。
注：由于测试设备的多样性，色谱条件可依超高效液相色谱仪的型号作相应调整。
7.4标准曲线的制作
按照7.3测试条件，将混合标准工作液（5.20）注入超高效液相色谱仪（6.1）中进行测试，测定相应的峰面积，以混合标准工作液（5.20）的浓度为橫坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
7.5试样溶液的测定
按照7.3测试条件，将待测样品溶液（7.2.3）注入超高效液相色谱仪（6.1）中进行测试。待测样品溶液中目标物质的响应值应在仪器线性相应范围内，否则应适当稀释。混合标准工作液（5.20）与待测样液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。番茄红素、叶黄素、a-胡萝卜素和β胡萝卜素混合标准色谱图见附录B。
8结果计算
试样中组分（番茄红素、叶黄素、a-胡萝卜素、β-胡萝卜素）的含量Xi的计算按式（1）进行：
式中：
Xi——试样中各组分的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
ρi——从标准工作曲线得到的试样溶液中各组分的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样品定容体积，单位为毫升（mL）；
f——稀释倍数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
100——换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。
9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
10检出限和定量限
本文件的检出限：当取样量为5g、定容体积为2 mL时，叶黄素的检出限为1μg/100 g，番茄红素、a-胡萝卜素和β-胡萝卜素的检出限均为0.6 μg/100 g。
本文件的定量限：当取样量为5 g、定容体积为2 mL时，叶黄素的定量限为3μg/100 g，番茄红素、a-胡萝卜素和β-胡萝卜素的定量限均为2.0 μg/100 g。
