中华人民共和国国家标准
GB 31613.6-2022
食品安全国家标准 猪和家禽可食性组织中
维吉尼亚霉素M1残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of virginiamycin M1 residue in edible tissues
of swine and poultry by liquid chromatography tandem
mass spectrometry method
1范围
本文件规定了猪和家禽可食性组织中维吉尼亚霉素M1残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪和家禽（包括鸡、鸭和鹅）的肌肉、肝脏、肾脏及皮+脂中维吉尼亚霉素M1残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试料中残留的维吉尼亚霉素M1，用乙腈提取，正己烷除脂，液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。
5试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5. 1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.1.3乙腈（CH3CN）。
5.1.4 正己烷（C6H14）。
5.2溶液配制
5.2. 1乙腈溶液：取乙腈600 mL、水400 mL，混匀。
5.2.2 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀释至1 000 mL，混匀。
5.3 标准品
维吉尼亚霉素M1（Virginiamycin M1，C28H35N3O7，CAS号：21411-53-0）含量≥90%。
5.4 标准溶液制备
5.4.1 标准储备液：取维吉尼亚霉素M1标准品10 mg，精密称定，用乙腈适量使溶解并稀释定容至200 mL棕色容量瓶，配制成浓度为50 μg/mL的维吉尼亚霉素M1标准储备液。4℃以下保存，有效期7 d。
5.4.2标准中间液：准确量取标准储备液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和3 mL，分别置50 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和3μg /mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液。4℃以下保存，有效期7 d。
5.5材料
5.5.1刻度试管：10 mL。
5.5.2有机滤膜：0.22 μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱串联质谱仪：配电喷雾电离源。
6.2分析天平：感量 0.0001 g和0.01 g。
6.3 均质机。
6.4超声仪。
6.5离心机：≥4 000 r/min。
6.6 涡旋振荡器。
6.7移液器 。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并均质。
a）取均质的供试样品，作为供试试样；
b）取均质的空白样品，作为空白试样；
c）取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-40℃以下保存，避免反复冻融。
8测定步骤
8.1 提取
取试料2 g（准确至±0.05 g），加乙腈4 mL（肌肉组织先加水2 mL），涡旋2 min，超声30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液转移至15 mL具塞离心管中。残渣加乙腈2 mL重复提取1遍，合并上清液，备用，得到提取液。
8.2净化
取上述提取液，加水至约9.5 mL，涡旋混合30 s加正己烷3 mL，涡旋30 s，4000r/ min离心10 min，弃去上层正己烷，重复除脂1次。将下层溶液转移至10 mL刻度试管中，加水至10 mL，涡旋混合30 s，备用。取备用液（肝脏：取备用液2.0 mL，加乙腈溶液4.0 mL，混匀；肾脏、皮脂：取备用液2.0 mL，加乙腈溶液6.0mL，混匀），过滤，供液相色谱-串联质谱法测定。
8.3标准曲线的制备
8.3.1家禽肌肉、肝脏基质匹配标准曲线的制备
准确量取浓度为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和3 μg/mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液各200 μL，分别加于按7.1和7.2正己烷除脂处理后的空白组织提取液中，加水至10mL，混匀，同法处理。制备成维吉尼亚霉素M1浓度为2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL和60ng/mL的系列基质匹配标准溶液，过滤，临用现配，供液相色谱联用质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为橫坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.3.2其 他组织标准曲线的制备
分别准确量取浓度为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和3 μg /mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液各200 μL，加乙腈溶液至10.0 mL，配制成维吉尼亚霉素M1浓度为2 ng/mL、10 ng/ mL、20 ng/mL、40 ng/mL和60 ng/mL系列标准工作液，临用现配，供液相色谱联用质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1色谱条件
a）色谱柱：C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），或相当者；
b）柱温：30℃；
c）进样量：5 μL；
d）流速：0.2 mL/min；
e）流动相：A为乙腈，B为0. 1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。
8.4.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测（MRM）；
d）离子源温度：150℃；
e）脱溶剂温度：200℃；
f）毛细管电压：3.0 kV；
g）脱溶剂气流速：800 L/h。
h）锥孔反吹气流速：150 L/h。
i）定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。
8.5 测定法
8.5. 1定性测定
在相同的测试条件下，试料溶液中维吉尼亚霉素M1色谱图的保留时间与相应标准工作液中保留时间偏差应不大于±2.5%；且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.5.2 定量测定
取试料溶液和相应的基质匹配标准工作液/标准工作液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积定量，基质匹配标准工作液/标准工作液及试料溶液中的维吉尼亚霉素M1；响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，维吉尼亚霉素M1基质匹配标准溶液的特征离子质量色谱图见附录A。
8.6空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
9结果计算
试样中维吉尼亚霉素M1残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中维吉尼亚霉素M1残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——标准工作液中维吉尼亚霉素M1浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液中维吉尼亚霉素M1峰面积；
V——定容后溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
As——标准工作液中维吉尼亚霉素M1峰面积；
f——稀释倍数；
n——试样质量的数值，单位为克（g）。
10 方法灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法维吉尼亚霉素M1在肌肉、肝脏、肾脏和皮脂的检测限分别为2μg/kg、6μg/kg、8μg/kg和8 μg/kg，肌肉的定量限为10μg/kg，其他组织定量限为50μg/kg。
10.2准确度
本方法维吉尼亚霉素M1在家禽和猪肌肉组织10μg/kg~ 200μg/kg、肝脏和肾脏组织50 μg/kg~600μg/kg、皮脂组织50μg/kg~800μg/kg测定浓度水平上的回收率为70%~120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
