中华人民共和国国家标准
GB/T 20365-2006
硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定 液相色谱法
Determination method for chondroitin sulfate and glucosamine hydrochloride-Liquid chromatography method
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录。
本标准由中华人民共和国山东出入境检验检疫局提出。
本标准由中华人民共和国山东出入境检验检疫局负责起草。
本标准主要起草人：牛增元、王岩、孙忠松、袁玲玲、王境堂、纪雷。
1范围
本标准规定了用液相色谱法测定硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的方法。
本标准适用于从牛、猪和鲨鱼等动物软骨组织中提取的硫酸软骨素及其中的盐酸氨基葡萄糖的测定。
2规范性引用文件
下列标准文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO 3696：1987）
3原理
用乙腈将硫酸软骨素样品分散均匀，以水溶解，经液相色谱分离后，在波长192 nm测定，外标法定量。
4试剂和材料
4.1水：GB/T 6682规定的一级水。
4.2乙腈：液相色谱级。
4.3戊烧磺酸钠：纯度≥99.5%。
4.4硫酸软骨素A标准品：纯度约70% ，其余为硫酸软骨素C，结构式参见附录A。
4.5硫酸软骨素 B标准品：纯度约90%，其余为硫酸软骨素A和C，结构式参见附录A。
4.6硫酸软骨素C标准品：纯度约90% ，其余为硫酸软骨素A，结构式参见附录A。
4.7盐酸氨基葡萄糖：纯度≥99.0%。
4.8标准溶液：称取25.0mg经105℃干燥4h的硫酸软骨素标准品A（或B，或C）和25.0mg盐酸氨基葡萄糖于烧杯中，加入5.0 mL乙腈，振荡使其分散均匀，再加入水，用超声波使其溶解，转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，硫酸软骨素浓度约为0.5mg/mL，盐酸氨基葡萄糖浓度约为0.5 mg/mL。
4.9戊烷磺酸钠溶液：称取0.87g戊烷磺酸钠溶液用500mL水溶解，该溶液的浓度为10mmol/L。
5仪器和设备
5.1超声波发生器。
5.2分析天平：感量为0.1 mg。
5.3高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
5.4滤膜：聚四氟乙烯膜（PTFE），0.2μm。
6测定步骤
6.1 样品溶液的制备
当样品是颗粒状态时，需要先将其在研钵中研细成粉末。
将粉末状样品在105℃下干燥4 h。称取25.0mg样品于50 mL烧杯中，加入5.0 mL乙腈，振荡使其分散均匀，再加入水，用超声波使其溶解，转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。用液相色谱仪测定前，样品溶液用0.2μm滤膜过滤。
6.2色谱条件
a）流动相：乙腈+戊烷磺酸钠溶液（10+90）；
b）色谱柱：C18（用极性小分子封尾），粒径5 μm，柱长250 mm，内径4.6 mm；
注：可用NUCLEODUR C18 Pyramid色谱柱，或其他相当者。
c）流速：0.8 mL/min；
d）检测波长：192 nm；
e）进样体积：10 μL。
6.3色谱测定
分别将标准溶液、样品溶液注入液相色谱仪进行测定，记录色谱峰面积。从牛软骨组织中提取的硫酸软骨素样品使用硫酸软骨素A标准品，从猪软骨组织中提取的硫酸软骨素样品使用硫酸软骨素B标准品，从鲨鱼软骨组织中提取的硫酸软骨素样品使用硫酸软骨素C标准品。标准溶液的典型色谱图参见附录B。
7结果的计算
被测物的含量按式（1）计算：
式中：
Wi——样品中被测物的百分含量，%；
Ai——样品溶液中被测物的色谱峰面积；
mis——标准溶液中被测物标准品的质量，单位为毫克（mg）；
Ais——标准溶液中被测物标准品的色谱峰面积；
m——样品的质量，单位为毫克（mg）。
8精密度
在重复性条件下，硫酸软骨素获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的0.5%；盐酸氨基葡萄糖获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的1.5%。
