中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5515-2023
出口食品中氟唑菌酰胺残留量的测定
液相色谱-质谱/质谱法
Determination of fluxapyroxad residue in foods for export-
LC-MS/MS method
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国黄岛海关、青岛海关技术中心、中华人民共和国青岛海关、中国石油大学（华东）。
本文件主要起草人：郭庆龙、孙强、崔淑华、张谦、王萍、刘宏玉、曾景斌。
1 范围
本文件规定了出口食品中氟唑菌酰胺残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。
本文件适用于蔬菜、水果、糖料、谷物、油料和油脂、坚果、动物组织、乳、蛋、蜂蜜、干制水果、调味料和茶叶中氟唑菌酰胺残留量的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 方法提要
试样中氟唑菌酰胺残留用乙腈提取，分散固相萃取净化，液相色谱-质谱/质谱检测，外标法定量。
5 试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 乙腈：色谱纯。
5.2 甲醇：色谱纯。
5.3 甲酸铵：色谱纯。
5.4 氯化钠。
5.5 无水硫酸镁：于500℃马弗炉内灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用。
5.6 N-丙基乙二胺（PSA）：粒径40μm~60μm。
5.7 十八烷基硅烷键合相（C18）：粒径40μm~60μm。
5.8 石墨化炭黑（GCB）：粒径40μm~120μm。
5.9 有机相滤膜：0.22μm。
5.10 5 mmol/L甲酸铵溶液：称取0.315 g甲酸铵溶解于适量水中，并定容至1 000 mL。
5.11 氟唑菌酰胺标准物质（C18H12F5N3O，CAS号907204-31-3）：纯度≥99%。
5.12 标准储备液的配制：准确称取氟唑菌酰胺标准物质25 mg（精确至0.1 mg）于25 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 000 mg/L的标准储备液，于-18℃以下避光保存，有效期12个月。
5.13 标准中间溶液的配制：准确移取标准储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成浓度为10 mg/L的标准中间溶液，于0℃~4℃冰箱内避光储存，有效期3个月。
5.14 基质标准工作溶液：准确吸取适量的标准中间溶液，用样品空白基质溶液配制成0.000 5 μg/mL、0.001 μg/mL、0.002 μg/mL、0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL浓度水平的系列标准工作溶液。该溶液现用现配。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-三重四级杆质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。
6.2 高速组织捣碎机。
6.3 高速粉碎机。
6.4 匀浆机。
6.5 天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.6 振荡器：转速不低于200 r/min。
6.7 超声波清洗仪。
6.8 离心机：转速不低于8 000 r/min。
6.9 涡旋振荡器：转速不低于2 500 r/min。
6.10 马弗炉。
7 试样制备与保存
7.1 黄瓜、甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、马铃薯、荷兰豆、苹果、橙子、草莓、甜菜
取500 g代表性样品，用匀浆机制成匀浆，均分成两份，分别装入洁净容器中作为测试样品和备份样品，密封并做好标识。于-18℃以下保存。
7.2 大米、玉米、花生仁、榛子、干辣椒、葡萄干、绿茶
取500 g代表性样品，用高速粉碎机处理至粉状，均分成两份，分别装入洁净容器中作为测试样品和备份样品，密封并做好标识。于-18℃以下保存。
7.3 猪肉、鸡肝、羊脂肪
取500 g代表性样品，用高速组织捣碎机制成糊状，均分成两份，分别装入洁净容器中作为测试样品和备份样品，密封并做好标识。于-18℃以下保存。
7.4 牛奶、鸡蛋
取500 g代表性样品，鸡蛋应先去壳，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器中作为测试样品和备份样品，密封并做好标识。于-18℃以下保存。
7.5 蜂蜜
取500 g代表性样品，对于无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对于有结晶的样品，在密闭的情况下，低于60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时应注意水分的蒸发。将样品均分成两份，分别装入洁净容器中作为测试样品和备份样品，密封并做好标识。于-18℃以下保存。
8 分析步骤
8.1 提取及净化
8.1.1 黄瓜、甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、马铃薯、荷兰豆、苹果、橙子、草莓、甜菜
称取试样10 g（精确至0.01 g），置于50 mL具塞离心管中，准确加入20.0 mL乙腈，涡旋振荡1 min，振荡提取10 min。加入3.0 g无水硫酸镁和2.0 g氯化钠，迅速涡旋振荡1 min，8 000 r/min离心5 min。称取150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA 和50 mg C18 置于2 mL离心管（对于颜色较深的试样，2 mL离心管中另加入7.5 mg GCB），移取1 mL提取上清液转移至已加入净化剂的2 mL离心管中，涡旋振荡1 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm 有机微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱测定。
8.1.2 大米、玉米、蜂蜜
称取试样4 g （精确至0.01 g），置于50 mL具塞离心管中，根据试样含水量情况加适量水混匀（加水量一般为5 mL~8 mL），放置30 min。准确加入20.0 mL乙腈，涡旋振荡1 min，振荡提取10 min。加入3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，迅速涡旋振荡1 min，8 000 r/min离心5 min。称取150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA 和50 mg C18 置于2 mL离心管（对于颜色较深的试样，2 mL离心管中另加入7.5 mgGCB），移取1 mL提取上清液转移至已加入净化剂的2 mL离心管中，涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm 有机微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱测定。
8.1.3 干辣椒、葡萄干、绿茶
称取试样2 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，试样中加5 mL~10 mL水混匀，放置30min。准确加入20.0 mL乙腈，涡旋振荡1 min，振荡提取10 min，超声提取10 min后，加入3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，迅速涡旋振荡1 min，8 000 r/min离心5 min。称取150 mg无水硫酸镁、50 mgPSA 和50 mg C18 置于2 mL离心管（对于颜色较深的试样，2 mL离心管中另加入7.5 mg GCB），移取1 mL提取上清液转移至已加入净化剂的2 mL离心管中，涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm 有机微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱测定。
8.1.4 花生仁、榛子、猪肉、鸡肝、羊脂肪、牛奶、鸡蛋
称取试样4 g （精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，根据样品含水量情况加适量水混匀（牛奶不加水，鸡蛋加入3 mL 水，其余加入5 mL 水），放置30 min。准确加入20.0 mL 乙腈，于涡旋振荡1 min，振荡提取10 min，超声提取10 min后，加入3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，迅速用涡旋振荡1 min，8 000 r/min离心5 min，将该离心管置于-18 ℃冰柜中冷冻30 min。称取150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA 和50 mg C18 置于2 mL 离心管（对于颜色较深的试样，2 mL 离心管中另加入7.5 mgGCB），从冷冻30 min后的离心管中迅速移取1 mL提取上清液转移至已加入净化剂的2 mL离心管中，涡旋振荡1 min，8000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm 有机微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱测定。
8.2 测定
8.2.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18柱，100 mm×2.1 mm，1.8μm，或相当者；
b）流速：0.2 mL/min；
c）进样量：2μL；
d）柱温：30℃；
e）流动相及梯度洗脱条件见表1。
8.2.2 质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）电离方式：电喷雾电离（ESI）；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测模式（MRM）；
d）使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录A。
8.2.3 定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果被测试样中目标色谱峰的保留时间与基质标准溶液氟唑菌酰胺色谱峰的保留时间相差不超过±2.5%，氟唑菌酰胺子离子均出现，离子丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比，其允许的相对偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在氟唑菌酰胺。
8.2.4 定量测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作溶液一起进行色谱分析。标准工作溶液和待测液中氟唑菌酰胺的响应值应在仪器线性相应范围内。如果试样溶液浓度超过标准曲线的上限，须用乙腈稀释试样溶液至线性范围后再进行测定。在上述仪器条件下，氟唑菌酰胺的参考保留时间为4.5min。氟唑菌酰胺的液相色谱-质谱/质谱多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。
8.2.5 空白试验
除不称取试样外，均按上述操作步骤进行。
9 结果计算和表述
试样中被测物质的残留量由液相色谱-质谱/质谱仪的数据处理软件或按公式（1）计算样品中氟唑菌酰胺的残留量。计算结果应扣除空白值，保留两位有效数字。
式中：
X——样品中氟唑菌酰胺的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c ——从基质标准曲线得到的试样测定液中氟唑菌酰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V ——试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m ——最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。
10 定量限和回收率
10.1 定量限
黄瓜、甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、马铃薯、荷兰豆、苹果、橙子、草莓、甜菜中氟唑菌酰胺定量限为0.002 mg/kg，大米、玉米、花生仁、榛子、猪肉、鸡肝、羊脂肪、牛奶、鸡蛋、蜂蜜中氟唑菌酰胺定量限为0.005 mg/kg。干辣椒、葡萄干、绿茶中氟唑菌酰胺定量限为0.01 mg/kg。
10.2 回收率
采用本方法对黄瓜、甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、马铃薯、荷兰豆、苹果、橙子、草莓、甜菜、大米、玉米、花生仁、榛子、猪肉、鸡肝、羊脂肪、牛奶、鸡蛋、蜂蜜、干辣椒、葡萄干和绿茶24种基质进行添加回收率试验，氟唑菌酰胺的添加水平及回收率参见附录C。
