中华人民共和国轻工行业标准
QB/T 5806-2023
海参及其制品中海参多糖的测定 液相色谱-质谱联用法
Determination of sea cucumber polysaccharides in sea cucumbers and their derived products-High performance liquid chromatography-mass spectrometer
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中国轻工业联合会提出。
本文件由全国食品工业标准化技术委员会（SAC/TC64） 归口。
本文件主要起草单位：大连工业大学、大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司、北京同仁堂健康（大连）海洋食品有限公司、獐子岛集团股份有限公司、大连晓芹食品有限公司、蓬莱深奥生物科技研究所、大连华信理化检测中心有限公司、通标标准技术服务有限公司大连分公司、华测检测认证集团股份有限公司、辽宁惠康检测评价技术有限公司、镇江华大检测有限公司。
本文件主要起草人：朱蓓薇、宋爽、董秀萍、李双双、焦健、张晓芳、周明学、洪杏德、曹阳、刘守峰、金馥、刘志奎、王继红。
本文件为首次发布。
1范围
本文件描述了采用液相色谱-质谱联用法测定海参及其制品中海参多糖的方法。
本文件适用于海参（包括楯手目海参科、楯手目刺参科、芋参目尻参科和枝手目瓜参科的海参品种）以及以上述海参为原料加工而成的即食海参、干海参、盐溃海参、海参胶囊、海参粉等制品中海参多糖（包括海参岩藻聚糖硫酸酯和海参岩藻糖基化硫酸软骨素）总量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
海参多糖sea cucumber polysaccharides
由海参岩藻聚糖硫酸酯和海参岩菜糖基化硫酸软骨素组成。海参岩藻聚糖硫酸酯是一类由L-岩藻糖聚合而成的硫酸化多糖：海参岩藻糖基化硫酸软骨素是一类主链结构由葡萄糖醛酸-乙酰氨基半乳糖重复单元构成、带有岩藻糖基支链的硫酸化多糖。
4方法提要
样品经碱解、醇沉后，得到海参多糖，经酸水解后得到岩藻糖（Fuc） 和软骨素二糖（CH），再经1-苯基-3-甲基- 5-吡唑啉酮（PMP）衍生化，采用配备反相柱色谱的液相色谱-质谱联用仪测定岩藻糖和软骨素二糖的含量，内标法定量，以岩藻糖和软骨素二糖的含量反映海参多糖中岩藻糖残基和软骨素的含量，进而计算出海参多糖的总量。
5试剂和材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 氨水：25%~28%（质量分数）。
5.2 硫酸软骨素标准物质：CAS N0.9082-07-9，纯度不小于95%。
5.3 L-岩藻糖标准物质：C6H12O5，CAS NO.2438-80-4，纯度不小于99%。
5.4 乳糖内标物：C12H22O11，CAS NO.63-42-3，纯度不小于99%。
5.5乙酸铵：色谱纯。
5.6 乙腈：色谱纯。
5.7缓冲溶液（pH为10）：称取54 g氯化铵溶于200 mL水中，转移至1L容量瓶中，再加入350 mL氨水（5.1），用水定容。
5.8 三氟乙酸（浓度为2.6 mol/L）：移取19.34 mL三氟乙酸于100 mL容量瓶中，用水稀释并定容。
5.9三氟乙酸（浓度为1.3 mol/L）：移取9.67 mL三氟乙酸于100 mL容量瓶中，用水稀释并定容。
5.10 PMP甲醇溶液（浓度为0.5 mol/L）：称取1.74 g的PMP，用20 mL甲醇溶解。现用现配。
5.11 1%醋酸水溶液：量取0.2 mL冰醋酸，加入19.8 mL水，混匀。
5.12乙酸铵溶液（浓度为20 mmol/L）：称取1.54 g的乙酸铵，用水溶解并稀释至1L。使用前，用微孔滤膜过滤。
5.13硫酸软骨素标准储备液（浓度为1.0 mg/mL）：称取硫酸软骨素（5.2） 10 mg，用水溶解并定容至10mL。-18℃保存，有效期24个月。
5.14岩藻糖标准储备液（浓度为1.0 mg/mL）：称取L-岩藻糖标准物质（5.3） 10 mg，用水溶解并定容至10mL。-18℃保存，有效期24个月。
5.15混合标准工作液：分别移取适量硫酸软骨素标准储备液（5.13）和岩藻糖标准储备液（5.14）， 用水逐级稀释成浓度为100μg/mL、50.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.00μg/mL、2.00μg/mL、1.00μg/mL的混合标准工作液。现用现配。
5.16乳糖内标工作液（质量浓度为10 μg/mL）：称取乳糖内标物（5.4）5 mg，用水溶解并稀释至500 mL。-18℃保存，有效期24个月。
5.17微孔滤膜：水系，0.22μm。
6仪器和设备
6.1电子天平：感量0.01g。
6.2 电子分析天平：感量0.000 1 g。
6.3粉碎机：转速不低于20 0000 r/min。
6.4旋涡混匀器： 最高转速不低于800 r/min。
6.5 恒温水浴振荡器：最高振荡速度不低于100 r/min。
6.6离心机：最高转速不低于4 000 r/min。
6.7 恒温干燥箱：温度最大允许误差±0.59℃。
6.8 氮吹仪：气体流量不低于1 L/min。
6.9 pH计：精度±0.1（pH）。
6.10高效液相色谱-三重四极杆质谱仪。
7测定步骤
7.1试样的制备
7.1.1 鲜海参、即食海参、盐渍海参或海参肠卵的试样制备
鲜海参（去掉内脏和沙嘴）、即食海参、盐渍海参或海参肠卵剪成不大于0.5 cm×0.5 cm的小块，70℃烘干12b取出后，冷却至室温（25℃），称里，记录含水量，粉碎，用标准目数为10目的箭网过滤，混匀备用。
7.1.2 干海参的试样制备
干海参粉碎，用标准目数为10目的筛网过滤，混匀备用。
7.1.3 胶囊的试样制备
取胶囊内容物，混匀备用。
7.1.4片剂的试样制备
片剂研磨粉碎，用标准目数为10目的筛网过滤，混匀备用。
7.2 海参多糖的提取和水解
7.2. 1试样中海参多糖的提取和水解
试样中海参多糖的提取和水解按以下步骤操作：
a）碱解：称取约0.2 g试样（精确至±0.001 g）于50mL 离心管中，加入10.00 mL缓冲溶液（5.7），于60℃下恒温振荡6h后，4000r/min下离心10 min。
b）醇沉：量取1.00 mL上清液于10 mL离心管中，加入4 mL乙醇，摇匀，4℃静置4h以上，
4 000 r/min离心10 min，缓慢倾斜离心管至倒立，倒掉上清液，留沉淀。
c）水解：向离心管中加入1.3 mol/L三氟乙酸（5.9） 0.5 mL， 旋涡混匀，再转移至5 mL具有螺口和胶垫片的水解管中，以上为1次，共操作3次（以保证离心管中沉淀全部转移至水解管中）。
密封水解管，放入恒温干燥箱中，设定温度105℃，水解3h。取出水解管，室温（25℃）冷却。氮吹除去溶剂，再加入0.5 mL甲醇，氮吹至完全干燥以除去残余三氟乙酸。
7.2.2混合标准工作液的水解
量取0.50 mL混合标准工作液（5.15）于5 mL具螺口和胶垫片的水解管中，再加入2.6 mol/L三氟乙酸（5.8）0.50mL，密封，放入恒温干燥箱中，设定温度105℃，水解3h，取出水解管，室温（25℃）冷却。氮吹除去溶剂，再加入0.5 mL甲醇，氮吹至完全干燥以除去残余三氟乙酸。
7.3 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化
7.3.1 PMP衍生化
向7.2.1得到的海参多糖水解物或7.2.2得到的混合标准品水解物中加入400μL氨水（5.1）， 使水解管中的残渣充分溶解，然后加入适量（推荐量100 μL）乳糖内标工作液（5.16）， 再加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液（5.10） 400μL，混匀，密封，70℃水浴加热反应30 min，氮吹除去溶剂。再加入0.5 mL甲醇，氮吹除去溶剂，以上为1次，重复2次，以除去残余氨。
7.3.2萃取
加入1%醋酸水溶液（5.11）1.00 mL，旋涡混匀，使残渣溶解。再加入1 mL氯仿，旋涡混匀，静置30 min，用1 mL注射器吸走氯仿层（下层），用氯仿重复萃取3次。取水层过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱检测。衍生后的试样应在48h内完成检测，否则应冻存（-18℃，6个月内）。
7.4 测定
7.4.1液相色谱参考条件
以下液相色谱条件供参考：
a）色谱柱：C18，150 mm×2.1 mm（内径），5μm，或性能相当者：
b）进样量：1μL；
c）柱温：30℃；
d）流动相：20mmo/L乙酸铵溶液（5.12）：乙睛（5.6）=-85：15、等度洗脱：
e）流速：0.5 mL/min。
7.4.2质谱参考条件
以下质谱条件供参考：
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多重反应监测（MRM）模式；
d）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、辅助加热气温度等应优化至最佳灵敏度，参考质谱参数见表1。
7.4.3 液相色谱质谱/质谱定性测定
在同样测试条件下，样品中待测物和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在±2.5%之内；且待测物定性离子的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度接近的标准洛液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
7.4.4液相色谱 质谱/质谱定量测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。 标准工作液和待测液中待测物的响应值应在仪器线性响应范围内。记录色谱峰面积，采用内标法定量。岩藻糖（Fuc）衍生物、软骨素二糖（CH）衍生物和乳糖（Lac）衍生物的多反应监测（MRM） 色谱图见附录A。
8结果计算和表述
试样中岩藻糖残基的含量按公式（1） 计算：
式中：
XFuc——试样中岩藻糖残基的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ；
ρFuc——被测液中岩藻糖的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样品的定容体积，单位为毫升（mL），此处取值10 mL；
146——聚合成多糖后岩藻糖残基的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；
m——试样质量，单位为克（g） ；
f——混合标准工作液的稀释倍数，此处取值2；
164——岩藻糖的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）。
试样中软骨素的含量按公式（2）计算：
式中：
XCH——试样中软骨素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρCH——被测液中硫酸软骨 素的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样 品的定容体积，单位为毫升（mL），此处取值10 mL；
m——试样质量，单位为克（g）；
f——混合标准工作液的稀释倍数，此处取值2；
19%——硫酸软骨素标准品中硫酸基团的含量；
试样中海参多糖含量按公式（3）计算：
式中：
X——试样中海参多糖的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ；
XFuc——试样中岩藻糖残基的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
XCH——试样中软骨素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）
ω——试样的制备步骤中记录的含水量，%。
27%——海参多糖中硫酸基团的含量。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到整数。
9定量限
本方法中海参多糖的定量限为1 000 mg/kg。
10正确度
本方法中，试样添加含量为1 000 mg/kg~30 000 mg/kg时，海参多糖的回收率为95%~105%。
11 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
