中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4440-2023
畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of tetracyclines， sulfonamides and quinolones residues in liquid manure of livestock and poultry-
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本文件按照GB/T 101-2020《标准化工作导则 第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC 274）归口。
本文件起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院都市农业研究所。
本文件主要起草人：陈（chen）刚、陶秀萍、王安如、贾曼、薛毅、胡剑。
1范围
本文件描述了畜禽液体粪污中4种四环素类（四环素、土霉素、金霉素和多西环素）、15种磺胺类（磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺苯吡唑、磺胺脒、磺胺醋酰钠、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹腮啉）和14种喹诺酮类（诺氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星、奥比沙星、恩诺沙星、达氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟甲喹、噁喹酸）药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、鸡等畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定。
本文件畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类33种药物残留量的测定方法检出限为2μg/L，定量限为5 μg/L。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27522畜禽养殖污水采样技术规范
3术语和定义
下列术语与定义适用于本文件。
3.1
畜禽液体粪污liquid manure of livestock and poultry
畜禽养殖过程中产生的粪便、尿液、污水、养殖垫料和少量散落饲料等组成的液体混合物。
注：一般指干物质（DM）含量<15%的畜禽粪污。
4原理
试样中待测物经Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙腈-甲醇溶液提取，QuEChERS方法净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准溶液校准，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2 甲醇：色谱纯。
5.3乙腈：色谱纯。
5.4 萃取盐包：每份含4 g无水硫酸钠及1 g氯化钠。
5.5 分散净化剂：每份含900 mg无水硫酸钠、150 mg C18及50 mg N-丙基乙二胺（PSA）。
5.6 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液：准确称取无水磷酸氢二钠10.9 g、乙二胺四乙酸二钠3 g、柠檬酸12.9 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
5.7乙腈-甲醇溶液：量取750 mL乙腈（5.3）与250 mL甲醇（5.2），混匀。
5. 8 80%甲醇溶液：量取800 mL甲醇（5. 2），加水定容至1 000 mL，混匀。
5.9 0.2%甲酸溶液：量取2 mL甲酸，加水定容至1 000 mL，混匀。
5. 10 0.2%甲酸甲醇溶液：量取2 mL甲酸，用甲醇（5.2）定容至1 000 mL，混匀。
5.11标准储备溶液（1 mg/mL） ：准确称取标准品（见附录A中表A.1）各10 mg（精确至0.01 mg），分别用表中标明的溶剂溶解，并用甲醇（5.2）定容至10 mL，混匀。置于-18℃以下避光保存。磺胺类和喹诺酮类标准储备溶液有效期为6个月，四环素类标准储备溶液有效期为1个月。
5.12混合标准中间溶液（5pg/mL）：准确吸取标准储备溶液（5.11）各50μL于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，现用现配。
5.13混合标准系列工作溶液：准确移取混合标准中间溶液（5.12）适量，用80%甲醇溶液（5.8）稀释成2ng/ mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL混合标准系列工作溶液，现用现配。
5.14 微孔滤膜：0.22 μm，有机系。
6仪器设备
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESD）。
6.2分析天平：感量0.01 mg和0.01 g。
6.3涡旋混合仪。
6.4冷冻离心机： 转速不低于10 000 r/min。
6.5氮吹仪。
6.6超声波清洗器。
7样品
7.1按照GB/T 27522的规定取样。取样后，样品应在-18℃以下保存。试验前，取适量恢复至室温的样品，混匀备用。
7.2空白样品：选取类型相同、均匀一致且在待测物保留时间处、仪器响应值小于方法定量限30%的畜禽液体粪污样品，作为空白试样。
8试验步骤
8.1提取
平行做2份试验。准确移取样品2 mL于50 mL离心管中，加入2 mL Naz EDTA-Mcllvaine缓冲液（5.6），涡旋混匀1 min，加入8 mL乙腈-甲醇溶液（5.7）提取，涡旋混匀后超声提取15 min，于4℃条件下10 000 r/min离心10 min。取全部上层清液于50 mL离心管中，加入萃取盐包（5.4），涡旋混匀1 min，静置10min盐析分层，于4℃条件下10 000 r/min离心10 min，取上层有机相，备用。
8.2 净化
取5 mL有机相（8.1）于15 mL离心管中，加入一份分散净化剂（5.5），涡旋混匀1 min，于4℃条件下10000r/min离心5min。取4mL上层清液于40℃水浴条件下氮气吹干，用80%甲醇溶液（5.8）定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜（5.14），供液相色谱-串联质谱仪分析测定。
8.3基质匹配标准系列溶液的制备
取空白样品若干份，按8.1和8.2处理，氮气吹干，得到空白基质。分别准确加入混合标准系列工作溶液各1 mL（5.13）复溶，配制成2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL基质匹配标准系列溶液。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱，柱长150 mm，内径3.0 mm，粒径1.8 μm，或性能相当者；
柱温：30℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：5μL；
流动相A：0. 2%甲酸溶液（5.9）；
流动相B：0.2%甲酸甲醇溶液（5.10）；
梯度洗脱程序见表1。
8.4.2 串联质谱参考条件
电离方式：电喷雾离子源，正离子模式（ESI+）；
监测方式：多反应监测（MRM）；
碰撞气（CAD）：34.475 kPa（5 psi）；
雾化气（GS1）：413.7 kPa（60 psi）；
辅助气（GS2）：413.7 kPa（60 psi）；
喷雾电压（IS）：5 000 V；
离子源温度（TEM）：500℃；
多反应监测（MRM）离子对、去簇电压及碰撞能量见表2。
8.4.3 定性
在相同试验条件下，试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差应在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹配系列标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
8.4.4 定量
以基质匹配标准系列溶液（8.3）的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。所测试样中药物的响应值应均在标准曲线的线性范围内。如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液作相应稀释后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差应不超过30%。33种药物的标准溶液定量离子色谱图见附录B。
9试验数据处理
试样中药物的残留量w以质量分数计，数值以微克每升（pg/L）表示。单点校准按公式（1）计算，多点校准按公式（2）计算。
式中：
A——试样溶液中待测物的色谱峰面积；
Cs——基质匹配标准系列溶液中待测物浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取溶液中有机相体积的数值，单位为毫升（mL）；
V2——氮吹所用净化溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
As——基质匹配系列标准溶液中待测物的峰面积；
V3——氮气吹干后复溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
v——试样体积的数值，单位为毫升（mL）。
式中：
Ci——从基质匹配标准曲线查得的试样溶液中待测物i的浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/
nL）；
V1——提取溶液中有机相体积的数值，单位为毫升（mL）；
V2——氮吹所用净化溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V3——氮吹吹干后复溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
v——试样体积的数值，单位为毫升（mL）。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
10精密度
在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。
