中华人民共和国国家标准
GB/T 43733-2024
植物中绿原酸类物质的测定 高效液相色谱法
Determination of chlorogenic acids in plants-
High-performance liquid chromatography
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院.深圳市农产品质量安全检验检测中心、上海市计量测试技术研究院、河南顺鑫检测科技有限公司、惠州市食品药品检验所、甘肃省商业科技研究所有限公司、深圳职业技术学院。
本文件主要起草人：张协光、杨俊、朱丽、肖伟敏、但琨、董珊、刘冬、邓梦雅、彭祖茂、杨雪、钱滢文、严虞虞、张彦军、黄秀丽、刘刚、王杰斌、黎海华、杨森、李兰英、杨国武。
1范围
本文件规定了植物中6种绿原酸类物质（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）的测定方法——高效液相色谱法。
本文件适用于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等样品中的6种绿原酸类物质（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
样品经50%甲醇水溶液超声提取，C18反相色谱柱分离，在波长327 nm处用高效液相色谱仪紫外检测器检测，相对保留时间定性，外标法定量。
5试剂或材料
如无特别说明，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.2乙腈（CH3CN）： 色谱纯。
5.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.4新绿原酸（C16H18O9，CAS号：906-33-2），纯度≥95%。
5.5绿原酸（C16H18O9，CAS号：327-97-9），纯度≥95%。
5.6隐绿原酸（C16H18O9，CAS号：90599- 7），纯度≥95%。
5.7异绿原酸A（C25 H24O12，CAS号：2450-53-5），纯度≥95%。
5.8异绿原酸B（C25 H24O12，CAS号：14534- 61-3），纯度≥95%。
5.9异绿原酸C（C25H24O12，CAS号：32451- 88-0），纯度≥95%。
5.10 0.1% 甲酸水溶液：准确吸取1 mL甲酸（5.3）于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀。
5.11 50%甲醉水溶液：准确量取250mL甲醇（5.1）和250mL水.混匀，作为提取溶剂。
5.12标准储备液（2.50mg/mL）：分别准确称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各0.025 g（精确至0.000 1 g），用甲醇（5.1）溶解并定容至10 mL。混匀后转入棕色玻璃容器中，4℃冰箱保存，保存期三个月。
5.13标准中间液（100ug/mL）：分别准确吸取标准储备液（5.12）各1.00mL于同一25mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀释至刻度，混匀。临用前配制。
5.14标准系列工作液；分别准确吸取标准中间液（5.13）0.500mL.2.50mL于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液（5.11）定容至100 mL；再分别准确吸取标准中间液（5.13）1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液（5.11）定容至10 mL。得到标准系列工作的质量浓度分别为0.500 μg/mL、2.50 μg/mL、10.0 μg/ mL、25.0 μg/ mL、50.0 μg/mL。临用前配制。
5.15 微孔滤膜（NY）：0.45 μm。
6仪器设备
6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。
6.2 电子天平：感量0.1 g和0.1 mg。
6.3涡旋振荡器。
6.4超声波振荡器。
6.5 离心机：转速不低于4 000 r/min。
7样品
7.1样品的制备
7.1.1含水量较低的固体样品：称取100g样品，粉碎均匀，制得均匀一致的样品，冰箱中冷藏保存。
7.1.2 新鲜水果和蔬菜类：称取500 g样品，粉碎均质，制得均匀一致的匀浆，冰箱中冷冻保存。
7.2样品的提取
准确称取2 g（精确到0.000 1 g）样品于50.0 mL离心管中，加入30 mL 50%甲醇水溶液（5.11），超声提取30 min，用50%甲醇水溶液（5.11）定容至刻度，混匀，离心。经0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。
8试验步骤
8.1 色谱参考条件
8.1.1 色谱柱：C18柱，5 μm，4.6 mm×250 mm（或相当型号色谱柱）。
8.1.2 流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液，淋洗梯度见表1。
8.1.3流速：1.0 mL/min。
8.1.4 柱温：30℃。
8.1.5检测波长：327 nm。
8.1.6 进样量：10 μL。
8.2标准曲线绘制
将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准品液相色谱图参见附录A的图A.1。
8.3样品测定
将样品溶液（见7.2）注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中绿原酸类各物质的浓度。样品液相色谱图可参考图A.2金银花样品中绿原酸类物质的液相色谱图。
注：必要时，对待测液进行稀释。
9分析结果的表述
样品中6种绿原酸类物质的含量按式（1）计算：
式中：
Xi——样品中各组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
ci——由标准曲线得到样品溶液中各组分的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
f——试液的稀释倍数；
mi——样品质量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
11其他
方法的检出限为1.5 mg/kg，定量限为5 mg/kg。
