中华人民共和国国家标准
农业部958号公告-12-2007
水产品中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱法
Determination of sulfonamide residues in aquatic products
High performance liquid chromatography
前言
本标准附录A、附录B为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）、农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（舟山）。
本标准主要起草人：郑斌、蔡友琼、于慧娟、陈伟斌、黄冬梅、陈雪昌、毕士川、钱蓓蕾。
1范围
本标准规定了水产品中14种磺胺类药物残留量的测定方法：液相色谱-紫外检测法、液相色谱-柱后衍生荧光检测法。
本标准规定了水产品中磺胺（sulfenilamide）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺5 -甲氧密啶（sulfameter）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine）、磺胺6-甲氧嘧啶（sulfamonome-thoxine）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole）、磺胺多辛（sulfadoxine）、磺胺异噁唑（sulfafurazole）、磺胺二甲氧哒嗪（sulfadimethoxine）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline）残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3液相色谱-紫外检测法
3.1 原理
样品中残留的磺胺类药物用乙酸乙酯提取，旋转蒸发至近干，甲醇溶解，正己烷脱脂，必威首页登录平台官网
净化，甲醇洗脱后旋转蒸发至干，用流动相定容，反相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3.2 试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682一级水的标准。
3.2.1标准品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉，纯度均大于98.0%。
3.2.2 乙酸乙酯。
3.2.3正己烷。
3.2.4乙腈：色谱纯。
3.2.5甲醇：色谱纯。
3.2.6冰乙酸：优级纯。
3.2.7无水硫酸钠： 经650℃灼烧4 h，置于干燥器内备用。
3.2.8 1%（V/V）乙酸溶液：取冰乙酸5.00 mL，加水稀释至500 mL。
3.2.9 2%（V/V）乙酸溶液：取冰乙酸20.00 mL，加水稀释至1 000 mL。
3.2.10标准储备液：称取各磺胺标准品10mg（精确至0.01mg），用甲醇分别溶解并定容至10mL。各磺胺标准储备液浓度为1 000 mg/L，避光冷藏保存，保存期为1个月。
3.2. 11混合标准中间液：适量移取各标准储备液（3.2.10），用甲醇稀释并定容至10 mL，在室温下混匀。其中磺胺嘧啶40 mg/L、磺胺噻唑40 mg/L、磺胺甲基嘧啶40 mg/L、磺胺5-甲氧嘧啶40 mg/L、磺胺二甲基嘧啶40 mg/L、磺胺甲氧哒嗪40 mg/L、磺胺氯哒嗪40 mg/L、磺胺6 -甲氧嘧啶40 mg/L、磺胺甲基异噁唑40mg/L、磺胺多辛40mg/L、磺胺异噁唑40mg/L、磺胺二甲氧哒嗪40mg/L、磺胺喹噁啉80 mg/L。避光冷藏保存，保存期为1周。
3.2 12 混合标准使用液：取混合标准中间液5 mL，用甲醇稀释并定容至100 mL。现配现用。
3.2. 13 必威首页登录平台官网
：60 mg/3 mL HLB（二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物），或其他等同效果的必威首页登录平台官网
。
3.3 仪器与设备
3.3. 1液相色谱仪：配紫外检测器。
3.3.2 电子天平：感量0. 0001g。
3.3.3电子天平：感量0.01g。
3.3.4高速组织捣碎机。
3.3.5旋转蒸发仪。
3.3.6均质机：14 000 r/min。
3.3.7 离心机：5 000 r/min。
3.3.8 旋涡混匀器。
3.3.9 马福炉。
3.3.10 玻璃抽滤器。
3.4 色谱条件
3.4.1色谱柱：ODS-C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm（i.d.），或性能相当者。
3. 4.2 柱温：40℃。
3.4.3 流动相：乙腈、甲醇和2%乙酸溶液（3.2.9），梯度洗脱参数见表1。
3.4.4流速：0.6 mL/min。
3. 4.5 检测波长：270 nm。
3.4.6进样量：50 μL。
3.5分析步骤
3.5.1样品制备
鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；样品切成不大于0.5cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混合。
3.5.2提取
将样品解冻，称取5.00g，置于50mL玻璃离心管。然后加入25mL乙酸乙酯，超声1min，加入5g无水硫酸钠，均质机14000 r/min均质1 min，旋涡混匀1 min，3000 r/min离心10 min，将乙酸乙酯层小心转移到100 mL梨形瓶中。再向原商心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋涡混匀1 min，3 000 r/min离心10 min，将乙酸乙酯层合并于100 mL梨形瓶中，于30℃水浴中减压浓缩至近干。
3.5.3净化
先用1mL甲醇溶解上述残渣，再加入1% 2mL乙酸溶液，涡旋混匀，超声1nin，转移到新的50mL玻璃离心管中，再向梨形瓶中加入1mL甲醇和2mL 1%乙酸溶液，涡旋混匀，超声1min，转移到50mL玻璃离心管中。向玻璃离心管中加入8 mL正己烷，涡旋混匀，3 000 r/ min离心5 min，弃上层正己烷层，再加入8mL正己烷重复操作一次，下层加水6mL稀释。HLB（3mL）必威首页登录平台官网
先分别用3mL甲醇和6mL水处理，处理完毕后，加入试样稀释液，再用3mL水和2mL5%甲醇淋洗，最后用10mL甲醇洗脱。洗脱液30℃减压浓缩至干，用1 mL流动相（乙腈+甲醇+2%乙酸溶液=5+10+85）定容，经孔径0. 45 μm微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。
3.5.4色谱分析
取50μL进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准品的保留时间定性，外标法定量。13 种磺胺参考保留时间参见附录A。
3.5.5工作曲线
取13种磺胺类药物标准中间液，用流动相稀释成标准工作液。取50 μL进样，以峰高为纵坐标，以标准样品中磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。
3.6计算
样品中磺胺类药物残留量按公式（1）计算。
式中：
X——样品中磺胺类药物的含量， 单位为微克每千克（μg/ kg）；
C——样品提取液 中磺胺类药物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——最终定容体积，单位为毫升（mL）；
M——样品质量，单位为克（g）。
3.7方法检出限
本方法检出限：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪为10μg/kg；磺胺喹噁啉为20 μg/ kg。
3.8 方法回收率
本方法回收率≥70%。
3.9 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的相对标准偏差≤15%。
3.10方法线性范围
方法线性范围；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪为0.01mg/L~1.0 mg/L，磺胺喹噁啉为0.02 mg/L~2.0 mg/L。
4液相色谱-柱后衍生荧光检测法
4.1 原理
样品中残留的磺胺类药物用乙酸乙酯提取，稀盐酸反提取，正己烷脱脂，反相色谱柱分离，荧光胺柱后術生，荧光检测器检测，内标法定量。
4.2 试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/ T 6682一级水的标准。
4.2.1标准品：磺胺、磺胺嘧啶、磺胺塞唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉，纯度均大于98. 0%。
4.2.2荧光胺（fluorescamine）：纯度大于99.0%。
4.2.3乙酸乙酯。
4.2.4盐酸。
4.2.5正己烷。
4.2.6甲醇：色谱纯。
4.2.7乙腈：色谱纯。
4.2.8冰乙酸：优级纯。
4.2.9乙酸钠：优级纯。
4.2.10 2 mol/L盐酸溶液：量取180 mL盐酸，加水定容至1 000 mL。
4.2.11 2%（V/V）乙酸溶液 ：量取20 rmL冰乙酸，加水定容至1 000 mL。
4.2.12 3.5 mol/L乙酸钠溶液：称取28.7 g无水乙酸钠溶于蒸馏水中，定容至100 mL。
4.2.13 0.2mg/mL荧光胺溶液：称取0.04g荧光胺，加100mL乙腈、20mL甲醇、80mL乙酸溶液，播匀，存放在暗处。现配现用。
4.2.14标准储备液：称取各种磺胺标准品各10mg（称准至0.01mg），用甲醇分别溶解并定容至10 mL，各磺胺标准储备液浓度为1 000 mg/L。避光冷藏保存，保存期为1个月。
4.2.15内标储备液：称取磺胺吡啶标准品10 mg（称准至0. 01 mg），用甲醇溶解并定容至10 mlL，该内标储备液浓度为1 000 mg/L。避光冷藏保存，保存期为1个月。
4.2.16混合标准中间液：适量移取标准储备液（4.2.14），用甲醇稀释并定容至10mL，在室温下混匀。其中磺胺20 mg/L、磺胺嘧啶40 mg/L、磺胺噻唑40 mg/L、磺胺甲基嘧啶40 mg/L、磺胺5 -甲氧嘧啶80 mg/L、磺胺二甲基嘧啶40 mg/L、磺胺甲氧哒嗪80 mg/L、磺胺氯哒嗪80 mg/L、磺胺6 -甲氧嘧啶80mg/L、磺胺甲基异噁唑80mg/L、磺胺多辛80mg/L、磺胺异噁唑80mg/L、磺胺二甲氧哒嗪80 mg/ L、磺胺喹噁啉160 mg/L。避光冷藏保存，保存期为1周。
4.2.17内标中间液：取内标储备液1mL，用甲醇稀释并定容至25mL，在室温下混匀，该内标中间液浓度为40 mg/L。避光冷藏保存，保存期为1周。
4.2.18混合标准使用液：取混合标准中间液5 mL，用乙酸乙酯稀释并定容至100 mL。现配现用。
4.2.19内标使用液：取内标中间液5 mL，用乙酸乙酯稀释并定容至100 mL，现配现用。
4.3仪器与设备
4.3. 1液相色谱仪：配荧光检测器，柱后衍生装置。
4.3.2电子天平：感量 0.0001 g。
4.3.3电子天平：感量0.01 g。
4.3. 4高速 组织捣碎机。
4.3.5均质机：14 000 r/min。
4.3.6离心机：5 000 r/min。
4.3.7氮吹仪。
4.3.8旋涡混匀器。
4.4色谱条件
4.4.1色谱柱：ODS- C18，5 μm，4. 6 mm×250 mm，或性能相当者。
4.4.2柱温：40℃。
4.4.3柱后 反应器温度：70℃。
4.4.4衍生试剂流速：0. 1 mL/min。
4.4.5流动相：乙腈、甲醇和2%乙酸溶液（4.2.11），梯度洗脱参数见表1。
4.4.6流速：0. 6 mL/min。
4.4.7进样量：50 μL。
4.4.8激发波长：405 nm。
4.4.9发射波长：495 nm。
4.5分析步骤
4.5. 1样品制备
按3.5.1条的规定执行。
4.5.2 提取
将样品解冻，称取10.00 g，置于50 mL离心管中。加入磺胺吡啶内标使用液250μL，然后加入乙酸乙酯30 mL，均质机14 000 r/min均质1 min，振动2 min，3 0000 r/min离心10 min，将乙酸乙酯层小心转移到100mL梨形瓶中，再向原离心管中加入乙酸乙酯20mL，旋涡混匀30s，振动2min，3 000 r/min离心10 min ，将乙酸乙酯层小心转移到原100 mL梨形瓶中，40℃减压浓缩至约1 mL，然后将梨形瓶中的溶液转移至15 mL刻度离心管，再用4 mL乙酸乙酯分两次清洗梨形瓶，溶液合并至15 mL刻度离心管。在离心管中加入2. 00 mL 2 mol/L盐酸溶液（4.2.10），旋涡混匀1 min，加盖后振动2 min，3 000 r/min离心8 min，移去乙酸乙酯层，在余液中加入正己烷5 mL，旋涡混匀30 s，3 000 r/min离心8min，移去正己烷层，0.45μm微孔滤膜过滤。取200μL滤液、200μL乙酸钠溶液、50μL乙腈和50 μL甲醇加入到试样瓶中，旋涡混匀1 min，供液相色谱分析。
4.5.3色谱分析
取50μL进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样品的保留时间定性，内标法定量。14 种磺胺参考保留时间参见附录B。
4.5.4工作曲线
称取空白样品10.00 g，分别添加混合标准使用液（4.2.18）25μL、100μL、250μL、500μL、1 000μL，同时分别添加内标使用液（4.2.19）250μL，按4.5.2、4.5.3操作，以磺胺峰高为纵坐标，磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。
4.6 计算
按3.6条的规定执行。
4.7方法检出限
本方法检出限：磺胺为2.5 μg/ kg；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶为5μg/kg；磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪为10μg/ kg；磺胺喹噁啉为20μg/ kg。
4.8回收率
本方法回收率≥70%。
4.9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对标准偏差≤15%。
4.10方法线性范围
方法线性范围：磺胺为0.0025mg/L~0.5mg/L，磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶为0.005 mg/ L~1.0mg/L，磺胺5 -甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪为0.01mg/L~2.0mg/L，磺胺喹噁啉为0.02 mg/L~4.0 mg/L。
