中华人民共和国国家标准
农业部958号公告-13-2007
水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定 气相色谱法
Determination of chloramphenicol， thiamphenicol and
florfenicol residues in fishery products
Gas chromatography method
前言
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。
本标准主要起草人：艾晓辉、李荣、刘永涛、袁科平、杨红。
1范围
本标准规定了水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的气相色谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中氯霉索、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
样品用乙酸乙酯提取，正己烷去脂，经C18必威首页登录平台官网
净化，硅烷化试剂行生化后，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定，外标法定量。
4试剂
本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯或更高纯度。试验用水符合GB/ T 6682一级水标准。
4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3正己烷： 优级纯。
4.4乙酸乙酯：色谱纯。
4.5氯化钠：分析纯。
4.6 4%氯化钠溶液：称取40 g氯化钠，用水溶解，定容至1 000 mL。
4.7氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准品：纯度≥99%。
4.8氯霉素标准储备液：准确称取0.01g（精确到0.0001g）氯霉素，加少量乙腈溶解，用乙腈定容至100mL棕色容量瓶中，保存于4℃冰箱中（保存期不超过3个月）。该氯霉素标准储备液浓度为100 μg/ mL。
4.9甲砜霉素标准储备液：精确称取0.01 g（精确到0.0001 g）甲砜霉素，加少量乙腈溶解，用乙腈定容至100 mL棕色容量瓶中，保存于4℃冰箱中（保存期不超过3个月）。该甲砜霉素标准储备液浓度为100 μg/ mL。
4.10氟甲砜霉素标准储备液：精确称取0.01 g（精确到0.000 1 g）氟甲砜霉素，加少量乙腈溶解，用乙腈定容至100 mL棕色容量瓶中，保存于4℃冰箱中（保存期不超过3个月）。该氟甲砜霉素标准储备液浓度为100 μg/mL。
4.11氯霉索、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准工作液：分别取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备液，用乙腈稀释成浓度范围分别为0.00μg/mL~0.1μg/mL、0.005μg/mL~0.5μg/mL、0.005μg/mL~0.5μg/mL的混合标准工作液，即氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素浓度比例以1：5：5为宜。
4.12 衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）（99：1）。
5仪器和设备
5.1气相色谱仪， 配63Ni电子捕获检测器。
5.2高速组织捣碎机：转速不低于20 000 r/min。
5.3旋转蒸发仪。
5.4离心机。
5.5旋涡混合器。
5.6电子天平：感量0.0001g。
5.7氮吹仪。
5.8 SPE固相萃取装置。
5.9必威首页登录平台官网
：3 mL，C18柱或相当者。
5. 10移液器：20μL~200μL，200μL~1 000μL。
5.11梨形瓶：125 mL。
5.12具塞离心管： 50 mL。
5.13反应瓶：规格3mL。
6样品测定
6.1 样品预处理
鱼，去鳞，沿脊背取肌肉和皮；虾，去头、去壳、去附肢，取可食肌肉部分；贝类，去壳，取可食部分；蟹、甲鱼等，取可食肌肉部分。样品切为不大于0. 5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，高速组织捣碎机充分匀浆，密封，标明标记。-18℃以下冷冻保存备用。
6.2 提取
称取匀浆样品5g（精确到0.01g），置于50mL具塞玻璃离心管中，加入20mL乙酸乙酯，在旋涡混合器上旋涡振荡5min，提取氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，4000r/min离心10min，将上清液转移到125 mL梨形瓶中。重复操作一次，合并乙酸乙酯提取液于125 mL梨形瓶中，置40℃旋转蒸发仪上蒸发至干。
6.3净化和浓缩
向鸡心瓶中加入1mL甲醇涡旋混合溶解残留物，再向梨形瓶中加入25mL 4%氯化钠溶液振荡1 min后，将其转移到50 mL具塞离心管中，然后向离心管中加入15 mL正己烷，涡旋振荡1 min，充分混合提取脂肪，4 000 r/min离心10 min，除去上层正己烷。向水相中加15 mL正己烷，重复提取1次，弃去正己烷。
给每个样品准备一根C18柱，依次用5mL甲醇和10mL水活化柱子，弃掉洗涤液，紧接着吸取待测样品水溶液过C18柱，弃掉流出液。再用5mL水洗涤C18柱，弃掉流出液。用3mL乙腈将C18柱中的氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素洗脱于3 mL反应瓶中，置50℃氮吹仪上吹干。以上步骤必须连续做完，切莫让吸附剂变干，过柱的流速保持约每秒一滴。吹干后的提取物，应迅速进行下一步衍生化操作或置80℃烘箱中20 min再冷却，确保提取物干燥。
6.4 衍生化
6.4.1试样的衍生化
向吹干的提取物中，加入100 μL BSTFA-TMCS衍生化试剂，立即盖塞，并旋涡振荡混合10s，在65℃恒温箱中反应30 min。置50℃氮吹仪上将衍生化溶液刚好吹干为止。加入1 mL正己烷，涡旋混合10s。取1μL进样测定。
6.4.2标准工作液的衍生化
取适量氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准工作液于3 mL反应瓶中，置50℃氮吹仪上吹干。以下按6.4.1的步骤操作。
6.5色谱条件
6.5. 1色谱柱：5%苯基和95%聚二甲基硅氧烷。
6.5.2进样方式：不分流进样。
6.5.3载气：氮气，纯度99.999%。
6.5.4柱流速：2.5 mL/min，尾吹为：25 mL/min。
6.5.5检测器温度310℃；进样口温度230℃。
6.5.6柱温程序：起始80℃保持1min， 以20℃/min，升至150℃，保持2 min；然后以20℃/min，升至200℃，保持5 min；再以50℃/min，升至280℃，保持10 min，直至样品的组分全部流出。
6.5.7进样量：1.0μL。
6.6样品测定
根据样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量，选定标准工作溶液浓度范围。标准工作溶液和样品中氯霉素、甲砜霉素氟甲砜霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。取1.0 μL衍生化的样液和标液进样测定，在6.5规定的色谱条件下，氯霉索保留时间约为18.87min，氟甲砜霉素保留时间约为19.78 min，甲砜霉素保留时间约为21.08 min，参见附录A，外标法定量。
6.7空白试验
同时测定试剂空白样品，方法按测定步骤进行。
7结果计算与表述
根据标准工作液和样液的峰面积，按式（1）分别计算样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量：
式中：
Ci——样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——标准衍生物溶液相当于氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；
Ai——样液中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉索的峰面积；
V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；
As——标准工作溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素峰面积；
m——样品的质量，单位为克（g）。
注：计算结果应扣除空白值，结果保留两位小数。
8线性范围
氯霉素线性范围为0.001μg/mL~0.1μg/mL；甲砜霉素线性范围为0.005μg/ mL~0.5μg/mL；
氟甲砜霉素线性范围为0.005μg/ mL~0.5μg/mL。
9灵敏度
氯霉素的检出限为0.3μg/kg，甲砜霉素的检出限为1.0μg/kg，氟甲砜霉素的检出限为1.0 μg/ kg。
10准确度
氯霉素在添加浓度为0.3μg/kg~5.0μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素在添加浓度为1.0μg/kg~10.0μg/kg时，回收率皆为70%~110%。
11 精密度
本方法批内和批间变异系数皆≤15%。
