中华人民共和国水产行业标准
SC/T 3020-2004
水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法
Determination of diethylstilbestrol residues in fishery products
Enzyme linked immuno sorbent assay
前言
本标准的附录A和附录B均为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。
本标准主要起草人：艾晓辉、刘长征、邹世平、徐忠法、李荣。
1范围
本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。
本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酚的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，加入己烯雌酚标准或样品溶液、己烯雌酚酶标记物、己烯雌酚抗体后，己烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗体的结合位点。结合的己烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测，吸收光强度与样品中的己烯雌酚浓度成反比，按校正曲线定量。
4试剂和材料
本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB/T 6682一级水标准。
4.1 叔丁基甲基醚：色谱纯。
4.2 石油醚。
4.3二氯甲烷。
4.4 甲醇：色谱纯。
4.5氢氧化钠：1 mol/L。
4.6磷酸：6 mol/L。
4.7 20%甲醇的20 mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH 8.5），40%、70%、80%的甲醇溶液，此溶液现用现配。
4.8 67mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：9.61 g磷酸氢二钠，1.79 g磷酸二氢钠溶解于蒸馏水，定容至1 000 mL，此溶液现用现配。
4.9己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒，参见附录A。
5仪器与设备
5.1酶标仪：波长 450 nm。
5.2离心机：转速 4000 r/min。
5.3氮吹仪。
5.4电热恒温水浴锅。
5.5 高速匀浆机。
5.6 C18固相提取柱：长6.5 cm，内径0.7 cm。
5.7固相萃取器。
5.8微型漩涡混合仪。
5.9 振荡器。
5.10 微量加样器：20μL、50μL、100μL、250μL、1 000μL。
5.11微量多通道加样器：50μL、100μL。
6样品处理
6.1 试样提取
取出鱼、虾蟹、鳖等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5 cm的小块后混匀，置冰箱中冷冻备用。
将样品解冻，取5 g（精确到0.01 g）样品于匀浆机的玻璃管中，加10 mL 67 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2），充分匀浆，称取3 g（精确到0.01 g）匀浆组织于20 mL玻璃离心管中，加入8 mL叔丁基甲基醚，强烈振荡20 min，4 00r/min离心10 min，转移出上清液至20 mL玻璃离心管中，再用8 mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次提取的醚相合并， 70℃水浴蒸发至干。
取70%的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，漩涡混合1min，4000r/min离心1 min，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1 mL二氯甲烷溶解，加1 mol/L氢氧化钠溶液3mL，漩涡振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液，加入6mol/L磷酸300μL中和提取液，用C18固相提取柱进一步纯化。
6.2样品纯化
将C18固相提取柱垂直固定，用3 mL无水甲醇洗涤柱子，再用2 mL 20%甲醇的20 mmol/L Tris缓冲液（pH 8.5）平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1 000 μL微量加样器全部加入柱中，过柱，然后用2 mL 20%甲醇的20 mmol/L Tris缓冲液（pH 8.5）洗涤柱子，接着用3 mL 40%的甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以于燥柱子。
用2 mL 80%的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴/s左右，可用固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加入2mL水，取20μL进行酶联免疫测定。
7酶联免疫测定
检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（参见附录A）。控制室温至20℃~24℃，取出足够数量的微孔条插入微孔架中，加入20μL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部，记录各标准液和样品的位置，标准和样品做两个平行实验。每个微孔中加入50μL稀释后的己烯雌酚抗体，微旋振荡混合，置2℃~8℃冰箱中孵育20h。
取出微孔架，回复到室温20℃~24℃，洗板（甩出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次），加入50μL稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分混合后，置室温孵育1 h，再洗板后（同上述洗板方法），每个微孔中加入50μL基质和50μL发色试剂，充分混合，并在室温暗处孵育30 min，每个微孔中再加入100 μL反应停止液，混合后在60 min内测量并记录每个微孔450 nm处的吸光度值。
8结果计算
8.1计算相对吸光度值
计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按公式（1）求出己烯雌酚标准液和样液的相对吸光度值。
式中：
Ri——相对吸光度值，单位为百分比（%）；
A0——空白标准的吸光度值；
Ai——标准或样品的平均吸光度值。
8.2绘制校正曲线
以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以己烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制出己烯雌酚标准液相对吸光度值与己烯雌酚浓度的校正曲线（参见附录B） ，校正曲线在0.05μg/L~0.4μg/L范围内应当成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酚依度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。
8.3结果计算
在8.2绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标准所采用的稀释系数为4） ，即为试样中的己烯雌酚残留量。
9检测限、回收率
9.1检测限
本方法的检测限为0.6μg/kg。
9.2回收率
本方法的回收率≥70%。
