中华人民共和国水产行业标准
SC/T 3029-2006
水产品中甲基睾酮残留量的测定 液相色谱法
Determination of methyltestosterone residues in fishery products
Liquid chromatography method
前言
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：中国海洋大学、国家水产品质量监督检验中心。
本标准主要起草人：林洪江洁、李兆新、曹立民、付晓婷。
1范围
本标准规定了水产品中甲基睾酮残留量的液相色谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中甲基睾酮残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
以乙醚提取样品中的甲基睾酮，经过液液萃取，用C18柱进行色谱分离，利用甲基睾酮具有紫外特征吸收，外标法定量。
4试剂
所有试剂应无干扰峰，分析纯试剂应重蒸。水应符合GB/T 6682一级水的要求。
4.1甲基 睾酮标准品：纯度≥98%。
4.2 甲醇：色谱纯。
4.3甲醇溶液：甲醇：水=4：1。
4.4石油醚：分析纯。
4.5无水乙醚：分析纯。
4.6甲基睾酮标准储备液：准确称取甲基睾酮0.0010g，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，使成浓度为20μg/mL的标准溶液，-18℃存放，存放时间不超过6个月。
4.7甲基睾酮标准工作液：使用前用甲醇稀释成1μg/mL工作液，可4℃暂时存放。
5仪器
5.1 液相色谱仪：配紫外检测器。
5.2 电子天平：感量0.0001 g。
5.3匀浆机。
5.4磁力搅拌器。
5.5离心机：最大转速5 000 r/min。
5.6 振荡器。
5.7减压旋转蒸发器。
5.8鸡心瓶：50 mL。
5.9具塞玻璃离心管：10 mL。
5.10 离心管：50 mL。
5.11聚四氟乙烯膜：孔径 0.45μm。
6操作方法
6.1样品处理
取水产品可食部分，切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀，充分匀浆，取5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL烧杯中。
6.2 分离纯化
6.2.1提取
向烧杯中加入15 mL乙醚，磁力搅拌15 min，转移至50 mL离心管中，用5 mL乙醚洗净烧杯，合并至离心管，5 000 r/min离心10 min，所得上清液转移至鸡心瓶；残渣用15 mL乙醚按上述方法再提取一次，所得上清液合并至鸡心瓶，在40℃左右水浴条件下减压旋转蒸发至干，残渣中加入5 mL甲醇溶液清洗瓶壁，溶液转移至10 mL具塞玻璃离心管中。
6.2.2纯化
加入4 mL的石油醚至上述离心管中，加塞剧烈振荡1min~2min，4 000 r/min离心10 min，用滴管吸弃上层石油醚层；下层加入4 mL的石油醚按上述方法再洗涤一次。下层甲醇溶液在40℃左右水浴条件下减压旋转蒸发至约0.5 mL，转移至10 mL具塞离心管。加入2 mL水清洗瓶壁，合并水溶液，加入4mL的乙醚，震荡1min~2min，混匀，4000r/min离心10min，吸取上层乙醚层于鸡心瓶中；下层用4mL乙醚再提取一遍，吸取上层，合并至鸡心瓶中。在40℃左右水浴条件下减压旋转蒸发至干，准确加入1 mL流动相溶解残渣。经聚四氟乙烯膜过滤，待上机分析。
6.3 测定
6.3.1 测定条件
6.3.1.1色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，柱填料粒径5μm；或相当者。
6.3.1.2流动相：甲醇：水= 70：30；流速：0.8 mL/min。
6.3.1.3柱温：30℃。
6.3.1.4 进样量：20μL。
6.3.1.5检测波长：254 nm。
6.3.2色谱分析
分别注入20 μL浓度为1μg/mL标准工作溶液和样品提取溶液于液相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。标准品色谱图见附录A。
7结果
7.1 计算
样品中甲基睾酮的含量按公式（1）计算。
式中：
X——样品中甲基睾酮含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——标准溶液中甲基睾酮含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；
A——试样液中甲基睾酮的峰面积；
V——样品提取物溶液体积，单位为毫升（mL）；
As——标准溶 液中甲基翠酮的峰面积；
m——样品重量，单位为克（g）。
7.2方法回收率
本方法的回收率≥75%。
7.3方 法检测限
本方法检测限：10μg/kg。
7.4 方法重复性
本方法重复性小于10%。
7.5方法的线性范围
本方法的线性范围：0.05μg/mL~ 10μg/mL。
