中华人民共和国国家标准
农业部1163号公告-9-2009
水产品中己烯雌酚残留检测 气相色谱-质谱法
Determination of diethylstilbestrol residues in fishery products
Gas chromatography-mass spectrometry method
前言
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省水产品质量检验中心、山东省海洋水产研究所。
本标准主要起草人：张秀珍、徐英江、宫向红、邢红艳、刘义豪、宋莉辉。
1范围
本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的气相色谱-质谱测定方法。
本标准适用于鱼、虾可食部分中己烯雌酚残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/ T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
以乙酸乙酯提取样品中的己烯雌酚，必威首页登录平台官网
净化，硅烷化试剂衍生化后，用气相色谱-质谱仪测定，外标法定量。
4试剂
所有试剂除另有规定外均为分析纯，试验用水符合GB/T 6682一级水要求。
4.1己烯雌酚标准品：纯度≥99%。
4.2乙酸乙酯：色谱纯。
4.3甲醇：色谱纯。
4.4正己烷：色谱纯。
4.5无水乙醚。
4.6无水碳酸钠。
4.7碳酸钠溶液： 10%（W/V）。称取10 g无水碳酸钠，溶于100 mL水中。
4.8己烯雌酚标准储备液：准确称取己烯雌酚标准品0.010 g，用甲醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，即浓度为100μg/mL的标准储备液，置于-18℃冰箱中保存，有效期为6个月。
4.9 己烯雌酚标准工作液：临用前，准确吸取己烯雌酚标准储备液，用甲醇稀释成浓度为
0.005μg/mL~0.25μg/mL标准工作液。
4. 10街生化试剂：N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）/三甲基氯硅烷（TMCS）体积比99：1。
5仪器
5.1气相色谱-质谱联用仪：配备电子电离（EI）离子源。
5.2分析天平： 感量0. 00001 g。
5.3旋涡混合器。
5.4高速冷冻离心机。
5.5 氮吹仪。
5.6旋转蒸发仪。
5.7固相萃取装置。
5.8具塞玻璃离心管：10 mL。
5.9 SLH必威首页登录平台官网
：500 mg，6 mL。
5.10样品反应瓶：2mL，去活，螺纹口。
6测定步骤
6.1样品预处理
取水产品可食部分，充分匀浆，冷冻保存备用。
6.2 提取
称取5 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入碳酸钠溶液（4.7）3 mL，乙酸乙酯20 mL，均质30s，7 000r/min离心10 mnin，移取乙酸乙酯层于100 mL梨形瓶中，残渣再加入10 mL乙酸乙酯，重复提取一次，合并乙酸乙酯层，于40℃旋转蒸发至干，用2 mL正己烷和乙酸乙酯（体积比为85：15）混合溶液溶解残留物，备用。
6.3净化
依次用5mL正己烷、5ml乙酸乙酯活化SLH必威首页登录平台官网
，取备用液过柱，控制流速不超过
2 mL/min，依次用2 mL正己烷，2 mL正己烷和乙酸乙酯（体积比为85 ； 15）混合溶液淋洗小柱，弃淋洗液，将必威首页登录平台官网
抽干，用10 mL正己烷和乙酸乙酯（体积比为80：20）混合溶液洗脱，流速控制不超过2 mL/min，收集洗脱液于10 mL具塞玻璃商心管中，50℃水浴中氮气吹干。用1.0mL无水乙醚溶解残留物，转移至样品反应瓶（5.10）中，氮气吹干。
6.4衍生化
6.4. 1试样的衍生化
于反应瓶中加入100μL術生化试剂（4.10），盖紧塞子，旋涡混合30s，80℃烘箱中衍生30min，用氮气吹干。加入0.5 mL，正己烷，漩涡混合10 s，供GCMS分析。
6.4.2标准溶液的衍生化
吸取一定量的己烯雌酚标准工作液于2mL样品反应瓶中，氮气吹干，再按6.4.1操作。
6.5 测定
6.5.1色谱条件
6.5.1.1色谱柱：HP-5 ms石英毛细管柱， 30m×0.25mm×0.25μm；或相当者；
6.5.1.2载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL/min；
6.5.1.3进样口温度：250℃；
6.5.1.4进样方式：无分流进样方式；
6.5.1.5进样量：1 μL；
6.5.1.6柱温；初始柱温150℃，以20℃/min升至180℃，保持10min，再以3℃/min升至230℃，保持4 min，再以30℃/min升到280℃保持2 min。
6.5.2质谱条件
6.5.2.1 离子源：EI源；
6.5.2.2离子源温度：230℃；
6.5.2.3四极杆温度：150℃；
6.5.2.4接口温度：280℃；
6.5.2.5溶剂延迟：12 min；
6.5.2.6选择离子监测（SIM）：己烯雌酚衍生物（m/z）：383、397、412、413。
6.5.3气相色谱-质谱分析
6.5.3. 1定性方法
样品峰与标准物质的保留时间之差不大于0.10min，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，要求样品峰的各选择离子相对强度与标准物质相应选择离子的相对强度之差不大于允许相对标准偏差（表1）。
6.5.3.2定量方法
以己烯雌酚衍生物定量离子（m/z 412）的峰面积单点或多点校准定量。当单点校准定量时，根据样品溶液中己烯雌酚含量情况，选择峰面积相近的标准工作液进行定量，结果以cis-DES衍生物峰和trans-DES衍生物的峰面积之和进行计算。同时，标准工作液和样品液中己烯雌酚响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
7结果计算
样品中己烯雌酚的含量按式（1）计算。
式中：
X——样品中己烯雌酚含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——标准工作溶液中己烯雌酚含量，单位为微克每毫升（μg/ mL）；
V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；
As1——标准工作溶液中cis-DES衍生物的峰面积；
As2——标准工作溶液中trans-DES衍生物的峰面积；
A1——试样液中cis-DES衍生物的峰面积；
A2——试样液中trans- DES衍生物的峰面积；
m——样品质量，单位为克（g）。
8灵敏度
本方法在鱼、虾中的定量限为0.5μg/ kg。
9准确度
本方法添加浓度为0.5μg/kg~10.0μg/kg时，回收率≥70%。
