15版药典中药材黄曲霉毒素检测方案

15版药典中药材黄曲霉毒素检测方案

15版药典中药材黄曲霉毒素检测方案

免疫亲和柱---光化学柱后衍生法

本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

光化学柱后衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）

荧光检测器检测，激发波长：360nm(365nm)   发射波长：450nm

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备

精密量取PriboFast^®STD#1082AFT黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂标示浓度分别为1.0µg/mL、 0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备溶液。精密量取储备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备

1.取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000转/分,普瑞邦均质器Pribolab^® WR800: 转速22,000 r/min）。

2.2500r/min离心5分钟或用槽纹滤纸过滤。

3.精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用PBS溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm,用PriboFast^®玻璃微纤维滤纸代替最好，性能较高，效率高）过滤。

4.准确移取20.0mL样品提取液，过PriboFast^® 免疫亲和柱，过柱时流速不能快，流速快的话回收效率差，建议采取重力过柱。

5.用PBS溶液20mL洗涤，洗涤液弃去。

6.为保证洗脱充分，建议以2.0mL色谱甲醇分三步进行洗脱，重力洗脱即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脱，当溶剂通过柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇进行洗脱，过柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脱，过柱前孵育30s，并使2-3mL空气通过柱体，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 (免疫亲和柱操作建议使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率)

液相色谱条件（光化学柱后衍生法）

流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

柱  温：30 ℃

进样量：20 μL

激发波长：360 nm；发射波长：450 nm

用PriboFast^®KRC光化学柱后衍生器(254nm)

流速：  0.8 mL/min    

保留时间:G₂: 10 min, G₁:12 min, B₂:14 min, B₁:18min（大约)

用PriboFast^®MDU光化学柱后衍生器(254nm)

流速：    1.2 mL/min    

保留时间：G₂: 3 min, G₁:5 min, B₂:6 min, B₁:9 min（大约)

测定法： 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，计算，即得。

【附注】

（1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

（2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。